Microbiota 및 STEMI 분석

고혈당증은 급성 관상동맥 증후군(ACS)으로 진단된 환자에서 흔히 발견되며 당뇨병이 있거나 없는 환자의 사망률을 독립적으로 예측합니다(1-4). 경피적 관상동맥 중재술(PCI)이 ST 분절 상승 심근경색(STEMI)의 초석이지만(4-6), 고혈당 환자의 심부전, 재경색 및 사망의 발생률은 여전히 ​​중요하며 사망률은 40명 이상입니다. % 이벤트 후 1년 후(4-5). 사실, 재협착 및 비재류 현상은 1차 PCI를 받는 고혈당 환자에서 더 나쁜 임상 결과로 이어지는 흔한 사건이며, 그 결과 죽상혈전성 색전술, 증가된 산화 스트레스 및 염증을 초래합니다(3-6). 고혈당증으로 인한 사망률 증가에 대응하기 위해 관상동맥 장치는 ACS 동안 혈당을 정상화하기 위해 인슐린 프로토콜을 구현했으며 동일한 인슐린 치료가 상충되는 결과를 보였습니다(7). 소규모 파일럿 연구, 중간 정도의 임상 시험 및 메타 분석 데이터는 인슐린 요법의 이점을 제안했습니다(1-3.5). 한편, 후속 무작위 임상 시험에서는 생존율 증가를 확인하지 못했습니다(7, 8). 더욱이 이중 항응집 요법이 현재 PCI로 치료되는 STEMI 환자의 치료 기반이라면(9), 점점 더 빈번해지는 항응집 요법 및 출혈 현상은 그들의 치료 효능을 감소시킬 수 있다(11-13). 따라서 이중 항응집 요법에 대한 개별 반응 및 고혈당 스트레스가 저항 메커니즘에 영향을 미치거나 미생물군에 의한 약리학적 기능 불활성화를 증가시킬 수 있습니다. 미생물군이라는 용어는 생태학적 틈새에 존재하며 "인간 미생물군"을 구성하는 미생물 게놈의 총체를 나타냅니다(14). 분석된 해부학적 영역에 따르면 우리는 장, 안구, 협측, 질 미생물군 등을 말합니다. MetaHIT 컨소시엄에 의해 metagenomic 방법으로 구현된 인간 장내 미생물의 DNA 분석은 인간 종의 150배에 해당하는 300만 개 이상의 유전자를 식별했습니다(16-21). 또한 고혈압 및 관상 동맥 질환과 같은 심혈관 질환은 발병을 결정할 수 있는 장내 장내세균, 피르미쿠테스 및 라토바실러스의 존재에 의해 강하게 조절됩니다(22). 이러한 맥락에서, PCI 전, 병원 퇴원 시 및 후속 조치 시 분변 미생물 분석은 대사-산화 과정의 변경이 있는 고혈당 환자를 식별하는 데 유용하다고 간주될 수 있으며, 전혈전증은 시술 후 더 나쁜 예후와 관련이 있습니다( 23 ). 분변 미생물군 샘플을 쉽게 얻을 수 있고 과학계와 일상적인 임상 실습에 미치는 관련 영향으로 인해 우리는 미생물군의 게놈, 대사 및 세포 분석과 함께 임상 연구를 고집하고 최대한 많이 추출해야 합니다. STEMI가 있는 고혈당 환자에게 가능한 한 정보를 제공합니다. 이 조사는 STEMI로 입원한 고혈당 환자의 과학적 연구 및 임상 실습에서 제안된 적이 없습니다. 실제로 많은 양의 증거에 따르면 고혈당증은 죽상동맥경화반과 혈전 모두에서 산화 스트레스와 염증 생성을 증가시키므로 STEMI에서 더 나쁜 결과를 결정하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 따라서 이벤트 기간 동안 분변 미생물의 분석은 이론적으로 고혈당증으로 인한 과도한 염증 및 산화 톤, 이중 항응집 요법 및 관상동맥 스텐트에 대한 조건화 저항성, PCI에 의한 관상동맥 재관류 후 조건화 전혈전 현상을 가진 고혈당증 환자를 식별할 수 있습니다. 따라서 저자는 급성 고혈당 및 정상혈당 관상동맥증후군 환자의 미생물군을 분석하기 위한 연구를 진행할 예정이다.

목적 이 연구의 주요 목적은 고혈당 STEMI 환자에서 PCI 전과 6개월 및 12개월 후에 채취한 분변 물질에 대한 미생물 및 활동의 변화를 평가하고 미생물의 변화가 관련될 수 있는지 평가하는 것입니다. 12개월 예후까지.

재료 및 방법 환자 본 연구는 고혈당 STEMI v/s 정상혈당 환자의 분변 샘플에서 미생물군과 그 활동의 가능한 변화의 영향을 조사하기 위한 코호트 연구입니다. 이 환자들은 Campania의 "Luigi Vanvitelli" 대학의 심장학 부서에서 채택한 일상적인 "실제" 치료 사례에 따라 치료를 받습니다. 퇴원 후 모든 환자는 STEMI 후 환자 관리 지침(6)에 표시된 대로 Campania 대학 "Luigi Vanvitelli" 및 "Luigi Vanvitelli"캄파니아 대학의 내과 VI 부서. 모든 환자는 후속 조치로 이벤트 후 12개월 동안 모니터링됩니다. 미국심장협회(American Heart Association)의 최근 정의에 따르면 고혈당증은 공복 혈당 수치 > 140 mg/dl(1, 9)로 정의됩니다. 12시간 이내에 증상이 시작되고 2개 이상의 인접한 말초 리드에서 ST 세그먼트가 1mm 상승하거나 2개 이상의 인접한 전흉부 리드 또는 새로 발병한 왼쪽 분기 블록에서 최소 2mm의 증상이 있는 모든 환자는 PCI를 고려할 것입니다. 포함 기준에는 18세 이상 및 STEMI 첫 번째 에피소드에 대한 입학이 포함됩니다. 이전 IMA 또는 이전 PCI 및/또는 바이패스가 있는 좌심실 박출률 <25%인 환자는 제외됩니다. 각각은 정보에 입각한 동의서에 서명한 후 연구에 포함됩니다. 일상적인 혈액학적 분석은 수용 당시, 의료 치료 및 가능한 관상 동맥 검사를 실시하기 전, 그리고 6개월 및 12개월 후에 수행됩니다. 이 시점에서 채취한 혈액 샘플의 일부에서 우리는 박테리아 대사의 산물인 트리메틸아민-N-옥사이드(TMAO)를 평가할 것입니다. TMAO의 상승된 혈청 수치는 유해한 심혈관 사건과 관련이 있습니다(24). 또한 PCI 전과 6개월 및 12개월 후 대변 샘플을 채취하여 미생물군을 분석합니다. 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행됩니다.

절차 이 연구에서 저자는 Campania의 "Luigi Vanvitelli" 대학의 심장학 부서에 입학하고 이중 응집 방지 요법으로 치료받은 STEMI 환자 집단을 평가할 것입니다. 모든 환자는 STEMI에 대한 최신 지침(6)의 제안된 프로토콜에 따라 치료됩니다. 환자는 2개의 그룹으로 분류될 것이다: 고혈당 환자 대 정상혈당 환자, 두 환자 그룹 모두 배설물 미생물총 분석, 사전 PCI 및 사전 이중 항혈소판 요법의 분석을 수행할 것이다. 미생물은 배설물에서 추출한 다음 준비하고 분석합니다. 엄청난 양의 미생물이 존재하는 것과 비교할 때 임상 실습에서 대부분의 장내 세균을 실험실에서 배양하는 것은 불가능합니다. 대변 ​​물질에서 추출한 박테리아 DNA(Next Generation Sequencing)를 시퀀싱하는 최신 기술 덕분에 이제 장내 미생물군을 완전하고 신뢰할 수 있게 식별할 수 있습니다. 존재하는 박테리아 종을 식별하는 것 외에도 저자는 미생물총(또는 장내세균불균형)의 전반적인 건강 정도, 일부 유용하거나 유해한 물질 생산의 효율성, 일부 기본 기능과 관련하여 미생물군의 적합성을 표현할 수 있습니다. 염증성 장 질환, 대사 질환 및 노화에 대한 미생물 총 자체의 대리인이자 성향입니다. 그 결과 엄청난 양의 데이터, 즉 Microbiota Passport라는 미생물의 진정한 신분증이 탄생했습니다.

샘플 준비 및 분석. 미생물상 시퀀싱을 위한 샘플은 분변 물질에서 수집되어 원래 샘플의 손상을 방지하기 위해 초저온(-80°C)에서 보관됩니다. 미생물군의 시퀀싱은 캄파니아 대학교 "Luigi Vanvitelli"의 미생물학 실험실에서 수행할 것입니다. 미생물군의 시퀀싱을 위해 우리는 "NextGeneration Sequencing"(NGS) 방법을 사용하여 Illumina 기계(San Diego, CA)를 사용하여 수백만 개의 DNA 단편(25)을 병렬로 시퀀싱할 수 있습니다. 높은 재현성 상용 키트 절차(Qiagen, Invitrogen)를 사용하여 이러한 샘플에서 DNA를 추출합니다. 추출된 DNA의 최종 수율 및 품질은 NanoDrop ND-1000 분광광도계(ThermoScientific, Waltham, MA) 및 QubitFluorometer 1.0(Invitrogen Co., Carlsbad, CA)을 사용하여 결정됩니다. 추출된 DNA는 16S의 초가변 영역 V3 및 V4를 대상으로 하는 정방향: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3' 및 역방향: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'(Klindworth et al.2013) 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭됩니다. rRNA 유전자 . 각 PCR 증폭은 metagenomic 시퀀싱을 위한 16S 라이브러리 준비를 위한 프로토콜(Illumina, San Diego, CA)에 의해 수행됩니다. 증폭 생성물은 Qubit 불소화제(Invitrogen Co., Carlsbad, CA)에 의해 정량화되고 최종 농도가 2nM인 각 샘플의 등몰량으로 그룹화됩니다. Phix 제어 라이브러리(Illumina)가 샘플에 추가됩니다. 그룹화된 샘플은 MiSeq 플랫폼(Illumina, San Diego, CA)에서 시퀀싱됩니다. 이렇게 얻은 데이터는 FastQC로 생물 정보학 분석을 통해 품질 관리를 받게 됩니다. 마지막으로, metagenomic sequencing에 대한 가이드라인에서 제안하는 통계적 테스트에 따라 데이터를 분석합니다. 환자 데이터는 참조 데이터베이스와 시간이 지남에 따라 서로 비교됩니다. 미생물군의 후생유전학적 활성과 사이토카인 및 자유 라디칼의 생화학적 투여량에 대한 평가는 캄파니아 대학교 "Luigi Vanvitelli"의 약리학 실험실에서 수행됩니다. 특히, 각 개별 STEMI 고혈당 v/s 정상혈당 환자의 미생물총의 후생유전적 활성 평가를 위해 저혈당을 포함하는 총 RNA의 대변 물질로부터 추출하여 프로토콜 QIAGEN(이탈리아)에 따라 진행할 것입니다. -가중 1분자(microRNA). 추출된 RNA의 최종 수율 및 품질은 NanoDrop ND-1000 분광광도계(ThermoScientific, Waltham, MA)를 사용하여 결정됩니다. qRT-PCR(QIAGEN, Italy)을 통해 miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 및 miR-663과 같은 분변 마이크로RNA의 발현 수준이 검출됩니다. 장내 미생물총의 조절에 관여; miR-10a 및 miR-18b는 장내 미생물 및 대사 염증 조절에 관여합니다. miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 및 miR-223은 대사성 염증 및 인슐린/IGF-1 신호 전달에 관여합니다(26). 각 개별 STEMI 고혈당 v/s 정상혈당 환자의 미생물군의 대사 활동은 대변 샘플에서 단쇄 지방산(SCFA)을 측정하여 평가됩니다. 세균 발효의 산물인 대변 SCFA의 수준은 제2형 당뇨병의 개선(27). 미생물총의 염증 활성은 LPS(28-29), IL-1β 및 IL-6(30-32)의 배설물 수준을 결정함으로써 평가될 것이며 산화 활성은 ROS, SOD 및 GSH(33-34).

후속 저자의 연구는 RCT의 일반화 가능성을 제한하는 엄격한 규칙의 간섭 없이 "실생활"에서 STEMI가 있는 고혈당 및 정상 혈당 환자를 관리하도록 설계되었습니다. 따라서 퇴원 후 모든 환자는 캄파니아 대학교 "Luigi Vanvitelli"의 심장과에서 STEMI 후 환자 관리 지침(6)에 표시된 대로 통제 방문을 수행하도록 초대됩니다. , 그리고 "Luigi Vanvitelli" 캄파니아 대학의 내과 VI 분과에서. 모든 환자는 STEMI 환자 관리 지침에 명시된 대로 임상 평가(ECG, 운동 테스트, 심초음파, 포도당 수치)를 실시하기 위해 후속 조치로 이벤트 후 12개월 동안 모니터링됩니다(6). 이 시점에서 대변 샘플도 미생물 분석을 위해 채취됩니다. 또한, 12개월 추적 관찰에서 혈당 보상의 관리 및 평가에서 의사는 HbA1c 수준을 <7%, 혈당을 90~140 mg/dl, 식후 혈당을 <180 mg으로 유지하기 위해 관여할 것입니다. / 디.

심혈관 종점 두 코호트의 심혈관 종점에는 심근 재경색, 관상 동맥 질환에 대한 재입원(재협착, 스텐트 이식 또는 대동맥-관상동맥 바이패스), 심부전, 뇌졸중, 심장 사망 및 모든 사망 원인이 포함됩니다. . 1차 복합 종말점은 심근 경색, 심부전으로 인한 입원, 뇌졸중 또는 심장 사망과 같은 심혈관 사건으로 구성됩니다. 2차 종료점은 심장 기능 평가로 구성됩니다: 박출률 감소, 좌심실 용적 증가, 관상 관류 감소. 모든 사망을 검토하고 심장(IMA로 인한 사망, 심실성 부정맥, 불응성 심부전) 또는 비심장으로 분류합니다. 모든 재혈관화는 조기(관상동맥 조영술 후 60일 이내에 선택적 혈관재개화) 또는 후기로 분류됩니다. 후기 혈관재개통술만 심장 사건으로 분류되므로 조기 선택 혈관재개통술을 받은 환자는 분석에서 제외됩니다.

통계 분석 두 그룹은 범주형 변수에 대한 Pearson χ2 테스트와 연속 변수에 대한 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비교됩니다. 다변량 모델에 들어가기 위한 공변량 후보는 고혈당 대/s 정상혈당 환자 사이의 단변량 분석에서 유의미하게 다른(P 값 <0.05) 요인에 집중하여 식별됩니다. Cox 회귀는 사망률 모델을 구축하는 데 사용됩니다. 사망률에 대한 위험 비율은 STEMI로 입원하는 동안 연령, BMI, 콜레스테롤, LDL, 트리글리세리드 및 아스피린 요법, 티클로피딘, 항응집제 조합, β-차단제, ACE 억제제 또는 사르탄, 항당뇨병제, 스타틴에 대해 조정됩니다. STEMI 첫해까지의 생존 분석은 Kaplan-Meier 곡선과 Cox 회귀 방법을 사용하여 수행됩니다. 사망률 곡선은 로그 순위 테스트를 사용하여 비교하기 위해 고혈당 환자 대 정상 혈당에 대해 별도로 얻을 것입니다. 모든 테스트는 p 값이 <0.05인 경우 중요한 것으로 간주됩니다. 모든 분석은 두 연구 모집단에서 수행됩니다. "경향 점수" 분석은 고혈당 v/s 정상혈당 환자의 결과를 비교할 "비 인색" 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 수행됩니다. 연령, 성별, 당뇨병, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 다혈관 질환, 만성 신부전, TIMI 시술 전 흐름, 박출률 및 시술 성공을 포함한 더 많은 변수가 모델에 포함될 것입니다. C-점수는 우수한 차별성을 나타냅니다. "일치된" 샘플을 기반으로 Cox 비례 위험 모델을 사용하여 고혈당증 및 미생물 균총 활동이 후속 조치 동안 사망률에 미치는 영향을 결정합니다. 모든 분석에는 SPSS(버전 21, IBM SPSS)가 사용됩니다.

샘플 크기 샘플 크기는 GPOWER 소프트웨어에 의해 IBM PC 컴퓨터로 계산됩니다. 크기 효과는 고혈당 환자에 대해 수행된 역학 및 중재 연구에 따라 계산됩니다. 제1종 오류 0.05, 검정력 95%, 전역 효과 25%로 추정되는 표본 크기는 200명의 참가자가 될 것이며, 정상혈당 환자로 구성된 그룹의 경우 100명, 고혈당 환자 그룹의 경우 100명이 될 것입니다.