Análisis de la Microbiota y STEMI

La hiperglucemia es un hallazgo frecuente en pacientes diagnosticados de síndrome coronario agudo (SCA) y es un predictor independiente de mortalidad en pacientes con y sin diabetes (1-4). Aunque la intervención coronaria percutánea (ICP) es la piedra angular del infarto de miocardio con elevación del segmento ST (IAMCEST) (4-6), la incidencia de insuficiencia cardíaca, reinfarto y muerte en pacientes con hiperglucemia sigue siendo significativa, con una mortalidad de más del 40 por ciento. % un año después del evento (4-5). De hecho, la reestenosis y los fenómenos de no reflujo son eventos comunes que conducen a peores resultados clínicos en pacientes hiperglucémicos sometidos a ICP primaria y que resultan en embolización aterotrombótica, aumento del estrés oxidativo e inflamación (3-6). En un intento de contrarrestar el aumento de la mortalidad por hiperglucemia, las unidades coronarias implementaron protocolos de insulina para normalizar la glucosa en sangre durante el SCA, y el mismo tratamiento con insulina mostró resultados contradictorios (7). Los datos de pequeños estudios piloto, de ensayos clínicos moderados y un metanálisis sugirieron beneficios de la terapia con insulina (1-3,5). Por otro lado, ensayos clínicos aleatorizados posteriores no han confirmado un aumento de la supervivencia (7, 8) . Además, si la terapia antiagregante dual es actualmente la base terapéutica de los pacientes con IAMCEST tratados mediante ICP (9), la terapia antiagregación cada vez más frecuente y los fenómenos hemorrágicos pueden reducir su eficacia terapéutica (11 -13). Por lo tanto, es probable que la respuesta individual a la terapia antiagregante dual y el estrés hiperglucémico puedan influir en los mecanismos de resistencia y/o conducir a un aumento de la desactivación funcional farmacológica por parte de la flora microbiótica. El término microbiota indica la totalidad de los genomas de microorganismos que residen en un nicho ecológico, y que constituyen la "microbiota humana" (14). Según el distrito anatómico analizado hablamos de microbiota intestinal, ocular, bucal, vaginal, etc. El análisis de ADN de microorganismos que viven en el tracto intestinal humano, realizado con métodos metagenómicos por el consorcio MetaHIT, ha identificado más de 3 millones de genes, 150 veces los de la especie humana (16-21). Además, las enfermedades cardiovasculares como la hipertensión y la enfermedad arterial coronaria están fuertemente condicionadas por la presencia de Enterobacteriaceae, Firmicutes y Lattobacilli en el intestino, lo que puede condicionar su aparición (22). En este contexto, el análisis de la microbiota fecal antes de la ICP, al alta hospitalaria y en el seguimiento, podría considerarse de utilidad para identificar pacientes hiperglucémicos con alteración de los procesos metabólico-oxidativos, y correlatos protrombóticos con peor pronóstico posprocedimiento ( 23 ). La facilidad para obtener muestras de microbiota fecal, y el relevante impacto en la comunidad científica, y en la práctica clínica habitual, nos empuja a insistir en la investigación clínica, junto con el análisis genómico, metabólico y celular de la microbiota, y extraer la mayor cantidad de información posible en pacientes hiperglucémicos con STEMI. Esta investigación nunca se ha propuesto en la investigación científica y la práctica clínica de pacientes hiperglucémicos hospitalizados por IAMCEST. De hecho, una gran cantidad de evidencia sugiere que la hiperglucemia provoca una producción creciente de estrés oxidativo e inflamación, tanto en la placa aterosclerótica como en el trombo, y por lo tanto juega un papel central en la determinación de peores resultados en STEMI. Por tanto, el análisis de la microbiota fecal durante el evento teóricamente podría identificar a los pacientes hiperglucémicos con un tono inflamatorio y oxidativo excesivo provocado por la hiperglucemia, condicionando la resistencia a la doble terapia antiagregante y al stent coronario, y condicionando los fenómenos protrombóticos tras la reperfusión coronaria mediante ICP. Por ello, los autores realizarán un estudio para analizar la microbiota en pacientes con síndrome coronario hiperglucémico y normoglucémico agudo.

OBJETIVOS El objetivo principal de este estudio será evaluar cualquier cambio en la microbiota y su actividad en la materia fecal tomada antes de la ICP, y después de 6 y 12 meses en pacientes con STEMI hiperglucémico, y también evaluar si los cambios en la microbiota pueden estar relacionados al pronóstico de 12 meses.

MATERIALES Y MÉTODOS Pacientes Este es un estudio de cohortes para investigar los efectos de posibles cambios en la microbiota y su actividad en muestras fecales tomadas de pacientes con IAMCEST hiperglucémicos v/s normoglucémicos. Estos pacientes son tratados según las prácticas terapéuticas rutinarias de la "vida real", adoptadas en la División de Cardiología de la Universidad "Luigi Vanvitelli" de Campania. Después del alta del hospital, todos los pacientes serán invitados a realizar las visitas de control, como lo indican las directrices para el manejo de pacientes post STEMI (6), en la División de Cardiología de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli "y en la VI División de Medicina Interna de la Universidad "Luigi Vanvitelli" de Campania. Todos los pacientes serán monitoreados durante los 12 meses posteriores al evento, como seguimiento. Según la reciente definición de la American Heart Association, la hiperglucemia se definirá por niveles de glucemia en sangre en ayunas > 140 mg/dl (1, 9). Todos los pacientes con aparición de síntomas dentro de las 12 horas y elevación de 1 mm del segmento ST en 2 o más derivaciones periféricas contiguas o al menos 2 mm en 2 o más derivaciones precordiales contiguas o bloqueo de rama izquierda de nueva aparición serán considerados para ICP. Los criterios de inclusión serán: edad mayor de 18 años e ingreso por primer episodio de IAMCEST. Se excluirán pacientes con fracción de eyección del ventrículo izquierdo < 25%, con IMA previa o ICP previa y/o by-pass. Cada uno será incluido en el estudio después de firmar un consentimiento informado. Se realizarán análisis hematológicos de rutina en el momento de la aceptación, antes de practicar la terapia médica y posible examen de las arterias coronarias y después de 6 y 12 meses. En una alícuota de la muestra de sangre extraída en estos momentos, evaluaremos el N-óxido de trimetilamina (TMAO), producto del metabolismo bacteriano, cuyos niveles séricos elevados se asocian con eventos cardiovasculares adversos (24). Además, antes de la ICP, y 6 y 12 meses después, se tomará una muestra de heces sobre la que posteriormente se analizará la microbiota. La investigación se llevará a cabo de acuerdo con los principios de la declaración de Helsinki.

Procedimiento En este estudio, los autores evaluarán una cohorte de pacientes con STEMI admitidos en la División de Cardiología de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli" y tratados con terapia antiagregante dual. Todos los pacientes serán tratados de acuerdo con los protocolos sugeridos en las últimas Directrices sobre STEMI (6). Los pacientes se clasificarán en dos grupos: pacientes hiperglucémicos v/s normoglucémicos, en ambos grupos de pacientes se realizará análisis de microbiota fecal, pre ICP y pre terapia antiagregante plaquetaria dual. La microbiota se extraerá de la materia fecal, se preparará y posteriormente se analizará. En la práctica clínica no es posible cultivar en el laboratorio la gran mayoría de las bacterias intestinales, frente a la enorme cantidad de microorganismos presentes. Gracias a las técnicas más modernas de secuenciación del ADN bacteriano (Next Generation Sequencing) extraído de la materia fecal, ahora es posible una identificación completa y fiable de la microbiota intestinal. Además de identificar las especies bacterianas presentes, los autores también pueden expresar un grado de salud general de la microbiota (o disbiosis), su eficiencia en la producción de algunas sustancias útiles o nocivas, la adecuación de la microbiota con respecto a algunas funciones fundamentales a la que es diputado y la propensión de la propia microbiota frente a las enfermedades inflamatorias intestinales, las enfermedades metabólicas y el envejecimiento. El resultado es una impresionante cantidad de datos, una verdadera tarjeta de identidad de la microbiota, denominada pasaporte Microbiota.

Preparación y análisis de muestras. Las muestras para la secuenciación de la microbiota se recolectarán de material fecal y se almacenarán a temperatura ultrabaja (-80 °C) para evitar dañar la muestra original. La secuenciación de la microbiota será realizada por el laboratorio de Microbiología de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli". Para la secuenciación de la microbiota utilizaremos el método “NextGeneration Sequencing” (NGS), que permite secuenciar en paralelo millones de fragmentos de ADN (25) mediante el uso de maquinaria Illumina (San Diego, CA). El ADN se extraerá de estas muestras utilizando un procedimiento de kit comercial de alta reproducibilidad (Qiagen, Invitrogen). El rendimiento final y la calidad del ADN extraído se determinarán utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA) y QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). El ADN extraído será amplificado por PCR con los cebadores: directo: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3' y reverso: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), que se dirigen a la región hipervariable V3 y V4 del 16S gen ARNr. Cada amplificación por PCR se realizará mediante protocolo para la preparación de bibliotecas 16S para secuenciación metagenómica (Illumina, San Diego, CA). Los productos de amplificación serán cuantificados por el fluorizador Qubit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) y agrupados en una cantidad equimolar de cada muestra con una concentración final de 2nM. Se agregará una biblioteca de control Phix (Illumina) a las muestras. A continuación, las muestras agrupadas se secuenciarán en la plataforma MiSeq (Illumina, San Diego, CA). Los datos así obtenidos serán sometidos a controles de calidad mediante análisis bioinformáticos con FastQC. Finalmente, los datos serán analizados según las pruebas estadísticas sugeridas por las guías de secuenciación metagenómica. Los datos de los pacientes se compararán entre sí y con el tiempo con bases de datos de referencia. La evaluación de la actividad epigenética de la microbiota y las dosis bioquímicas de citocinas y radicales libres se realizará en el laboratorio de Farmacología de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli. En particular, para la evaluación de la actividad epigenética de la microbiota de cada paciente individual hiperglucémico vs normoglucémico con IAMCEST, se procederá según el protocolo QIAGEN (Italia) con la extracción de materia fecal del ARN total, incluyendo el bajo -peso uno molecular (microARN). El rendimiento final y la calidad del ARN extraído se determinarán utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA). Mediante qRT-PCR (QIAGEN, Italia) se detectarán los niveles de expresión de los siguientes microARN fecales: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 y miR-663 implicada en la regulación de la microbiota intestinal; miR-10a y miR-18b implicados en la regulación de la microbiota intestinal y la inflamación metabólica; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 y miR-223 implicados en la inflamación metabólica y la señalización de insulina/IGF-1 (26). La actividad metabólica de la microbiota en cada paciente hiperglucémico versus normoglucémico con IAMCEST se evaluará mediante la determinación de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) de muestras fecales: los niveles de SCFA fecales, un producto de la fermentación bacteriana, parecen correlacionarse con una mejora en la diabetes tipo 2 (27). La actividad inflamatoria de la microbiota se evaluará mediante la determinación de los niveles fecales de LPS (28-29), IL-1β e IL-6 (30-32), mientras que la actividad oxidativa mediante el análisis de los niveles fecales de ROS, SOD y GSH (33-34).

Seguimiento El estudio de los autores está diseñado para tratar pacientes hiperglucémicos versus normoglucémicos con IAMCEST en la "vida real", sin la interferencia de las reglas rígidas que limitan la generalización de los ECA. Por lo tanto, después del alta del hospital, todos los pacientes serán invitados a realizar las visitas de control, como lo indican las directrices para el manejo de pacientes post STEMI (6), en la División de Cardiología de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli". , y en la VI División de Medicina Interna de la Universidad "Luigi Vanvitelli" de Campania. Todos los pacientes serán monitoreados durante los 12 meses posteriores al evento, como seguimiento, para practicar evaluación clínica (ECG, prueba de esfuerzo, ecocardiograma, niveles de glucosa), tal como lo indica la guía para el manejo de pacientes con IAMCEST (6). En estos momentos también se tomarán muestras de heces para el análisis de la microbiota. Además, en el manejo y valoración de la compensación glucémica en los 12 meses de seguimiento, también participará el médico para mantener niveles de HbA1c <7%, glucemia entre 90 y 140 mg/dl y glucemia posprandial <180 mg. / dl.

Criterios de valoración cardiovasculares Los criterios de valoración cardiovasculares en ambas cohortes incluirán reinfarto de miocardio, rehospitalización por arteriopatía coronaria (reestenosis, implantación de stent o derivación aortocoronaria), insuficiencia cardíaca, accidente cerebrovascular, mortalidad cardíaca y todas las causas de mortalidad. . El criterio principal de valoración compuesto consistirá en eventos cardiovasculares, como infarto de miocardio, hospitalización por insuficiencia cardíaca, accidente cerebrovascular o mortalidad cardíaca. El punto final secundario consistirá en la evaluación de la función cardíaca: reducción de la fracción de eyección, aumento del volumen del ventrículo izquierdo, reducción de la perfusión coronaria. Todas las muertes serán revisadas y clasificadas como cardíacas (muerte causada por IMA, arritmias ventriculares, insuficiencia cardíaca refractaria) o no cardíacas. Todas las revascularizaciones se clasificarán como tempranas (revascularización electiva dentro de los 60 días posteriores a la angiografía coronaria) o tardías. Solo las revascularizaciones tardías serán clasificadas como eventos cardíacos, por lo que los pacientes con revascularización electiva temprana serán excluidos del análisis.

Análisis estadístico Los dos grupos se compararán mediante la prueba de la χ2 de Pearson para variables categóricas y la prueba de Kruskal-Wallis para variables continuas. Las covariables candidatas para entrar en el modelo multivariable se identificarán concentrándose en los factores que diferirán significativamente (valor de P <0,05) en el análisis univariable entre pacientes hiperglucémicos versus normoglucémicos. Se utilizará la regresión de Cox para construir el modelo de mortalidad. El Hazard Ratio de mortalidad se ajustará por edad, IMC, colesterol, LDL, triglicéridos y terapia con aspirina, ticlopidina, combinación de antiagregantes, β-bloqueantes, IECA o sartans, antidiabéticos, estatinas, durante la hospitalización por IAMCEST. El análisis de supervivencia durante el primer año de STEMI se realizará utilizando la curva de Kaplan-Meier y el método de regresión de Cox. Las curvas de mortalidad se obtendrán por separado para pacientes hiperglucémicos v/s normoglucemia, para ser comparadas mediante el log-rank test. Todas las pruebas se considerarán significativas si el valor de p <0,05. Todos los análisis se realizarán en las dos poblaciones de estudio. Se realizará un análisis de "puntuación de propensión" utilizando un modelo de regresión logística "no parsimonioso" que comparará los resultados de los pacientes hiperglucémicos v/s normoglucémicos. Se incluirán más variables en el modelo, como la edad, el sexo, la diabetes, la hipertensión, la hipercolesterolemia, la enfermedad multivaso, la insuficiencia renal crónica, el flujo previo al procedimiento TIMI, la fracción de eyección y el éxito del procedimiento. La puntuación C indicará una buena discriminación. Sobre la base de las muestras "emparejadas", se utilizará el modelo de riesgo proporcional de Cox para determinar el impacto de la hiperglucemia y de la actividad de la flora microbiótica en la mortalidad durante el seguimiento. Se utilizará SPSS (versión 21, IBM SPSS) para todos los análisis.

Tamaño de la muestra El tamaño de la muestra se calculará con una computadora IBM PC mediante el software GPOWER. El tamaño del efecto se calculará de acuerdo con los estudios epidemiológicos e intervencionistas realizados en pacientes hiperglucémicos. El tamaño de muestra estimado sobre un efecto global del 25% con error tipo I de 0,05 y una potencia del 95% será de 200 participantes, 100 para el grupo compuesto por pacientes normoglucémicos y 100 para el grupo de pacientes hiperglucémicos.