Análise da Microbiota e STEMI

A hiperglicemia é um achado comum em pacientes diagnosticados com síndrome coronariana aguda (SCA) e é um preditor independente de mortalidade em pacientes com e sem diabetes (1-4). Embora a intervenção coronária percutânea (ICP) seja a pedra angular do infarto do miocárdio com elevação do segmento ST (STEMI) (4-6), a incidência de insuficiência cardíaca, reinfarto e morte em pacientes hiperglicêmicos permanece significativa, com uma mortalidade de mais de 40 % um ano após o evento (4-5). De fato, os fenômenos de reestenose e no-reflow são eventos comuns que levam a piores desfechos clínicos, em pacientes hiperglicêmicos submetidos à ICP primária, resultando em embolização aterotrombótica, aumento do estresse oxidativo e inflamação (3-6). Na tentativa de conter o aumento da mortalidade por hiperglicemia, as unidades coronarianas implementaram protocolos de insulina para normalizar a glicemia durante a SCA, e o mesmo tratamento com insulina apresentou resultados conflitantes (7). Dados de pequenos estudos piloto, de ensaios clínicos moderados e uma meta-análise sugeriram benefícios da terapia com insulina (1-3,5). Por outro lado, ensaios clínicos randomizados subseqüentes não confirmaram aumento da sobrevida (7,8) . Além disso, se a terapia antiagregante dupla é atualmente a base terapêutica de pacientes com STEMI tratados por ICP (9), a terapia antiagregante cada vez mais frequente e os fenômenos hemorrágicos podem reduzir sua eficácia terapêutica (11 -13). Portanto, é provável que a resposta individual à dupla antiagregação e o estresse hiperglicêmico possam influenciar os mecanismos de resistência e/ou levar a um aumento da desativação funcional farmacológica pela flora microbiótica. O termo microbiota indica a totalidade dos genomas de microorganismos que residem em um nicho ecológico e que constituem a "microbiota humana" (14). De acordo com o distrito anatômico analisado falamos de microbiota intestinal, ocular, bucal, vaginal, etc. A análise de DNA de microorganismos que vivem no trato intestinal humano, realizada com métodos metagenômicos pelo consórcio MetaHIT, identificou mais de 3 milhões de genes, 150 vezes os da espécie humana (16-21). Além disso, doenças cardiovasculares como hipertensão e doença arterial coronariana são fortemente condicionadas pela presença de Enterobacteriaceae, Firmicutes e Lattobacilli no intestino, que podem determinar seu aparecimento (22). Nesse contexto, a análise da microbiota fecal antes da ICP, na alta hospitalar e no seguimento, pode ser considerada útil para identificar pacientes hiperglicêmicos com alteração dos processos metabólico-oxidativos e correlatos pró-trombóticos com pior prognóstico pós-procedimento ( 23 ). A facilidade de obtenção de amostras da microbiota fecal, e o relevante impacto na comunidade científica, e na prática clínica de rotina, leva-nos a insistir na investigação clínica, aliada à análise genómica, metabólica e celular da microbiota, e a extrair o máximo informação possível em pacientes hiperglicêmicos com STEMI. Esta investigação nunca foi proposta na pesquisa científica e na prática clínica de pacientes hiperglicêmicos hospitalizados por STEMI. De fato, uma grande quantidade de evidências sugere que a hiperglicemia causa uma produção crescente de estresse oxidativo e inflamação, tanto na placa aterosclerótica quanto no trombo e, portanto, desempenha um papel central na determinação de piores resultados no STEMI. Portanto, a análise da microbiota fecal durante o evento poderia teoricamente identificar pacientes hiperglicêmicos com tônus ​​inflamatório e oxidativo excessivo causado pela hiperglicemia, condicionando resistência à dupla antiagregação e stent coronário e condicionando fenômenos pró-trombóticos após reperfusão coronariana por ICP. Portanto, os autores realizarão um estudo para analisar a microbiota em pacientes com síndrome coronariana hiperglicêmica e normoglicêmica aguda.

OBJETIVOS O objetivo primário deste estudo será avaliar quaisquer alterações na microbiota e sua atividade no material fecal coletado antes da ICP, e após 6 e 12 meses em pacientes com IAMCSST hiperglicêmico, e também avaliar se as alterações na microbiota podem estar relacionadas ao prognóstico de 12 meses.

MATERIAIS E MÉTODOS Pacientes Este é um estudo de coorte para investigar os efeitos de possíveis alterações na microbiota e sua atividade em amostras fecais coletadas de pacientes com IAMCSST hiperglicêmico v/s normoglicêmicos. Esses pacientes são tratados de acordo com as práticas terapêuticas de rotina da "vida real", adotadas na Divisão de Cardiologia da Universidade "Luigi Vanvitelli" da Campânia. Após a alta do hospital, todos os pacientes serão convidados a realizar as visitas de controle, conforme indicado pelas diretrizes para o manejo de pacientes pós-STEMI (6), na Divisão de Cardiologia da Universidade da Campânia "Luigi Vanvitelli "e no a VI Divisão de Medicina Interna da Universidade "Luigi Vanvitelli" da Campânia. Todos os pacientes serão acompanhados por 12 meses após o evento, como acompanhamento. De acordo com a recente definição da American Heart Association, a hiperglicemia será definida por níveis glicêmicos no sangue em jejum > 140 mg/dl (1, 9). Todos os pacientes com início dos sintomas dentro de 12 horas e elevação de 1 mm do segmento ST em 2 ou mais derivações periféricas contíguas ou pelo menos 2 mm em 2 ou mais derivações precordiais contíguas ou bloqueio de ramo esquerdo de início recente serão considerados para ICP. Os critérios de inclusão incluirão: idade superior a 18 anos e admissão para primeiro episódio de STEMI. Serão excluídos pacientes com fração de ejeção do ventrículo esquerdo <25%, com IMA ou ICP e/ou bypass anteriores. Cada um será incluído no estudo após a assinatura de um consentimento informado. A análise hematológica de rotina será realizada no momento da aceitação, antes da prática da terapia médica e possível exame da artéria coronária e após 6 e 12 meses. Em uma alíquota da amostra de sangue coletada nesses horários, avaliaremos a trimetilamina-N-óxido (TMAO), produto do metabolismo bacteriano, cujos níveis séricos elevados estão associados a eventos cardiovasculares adversos (24). Além disso, antes da ICP e 6 e 12 meses depois, será coletada uma amostra de fezes na qual a microbiota será posteriormente analisada. A pesquisa será conduzida de acordo com os princípios da declaração de Helsinki.

Procedimento Neste estudo, os autores avaliarão uma coorte de pacientes com STEMI admitidos na Divisão de Cardiologia da Universidade "Luigi Vanvitelli" da Campânia, e tratados com terapia antiagregante dupla. Todos os pacientes serão tratados de acordo com os protocolos sugeridos pelas últimas Diretrizes sobre STEMI (6). Os pacientes serão classificados em dois grupos: pacientes hiperglicêmicos v/s normoglicêmicos, em ambos os grupos de pacientes será realizada análise da microbiota fecal, pré ICP e pré dupla antiagregação plaquetária. A microbiota será extraída do material fecal, sendo então preparada e posteriormente analisada. Não é possível na prática clínica cultivar em laboratório a grande maioria das bactérias intestinais, face à enorme quantidade de microrganismos presentes. Graças às mais modernas técnicas de sequenciação do ADN bacteriano (Next Generation Sequencing) extraído da matéria fecal, é agora possível uma identificação completa e fiável da microbiota intestinal. Além de identificar as espécies bacterianas presentes, os autores também são capazes de expressar um grau de saúde geral da microbiota (ou disbiose), sua eficiência na produção de algumas substâncias úteis ou nocivas, a adequação da microbiota com relação a algumas funções fundamentais ao qual é adjunto e a propensão da própria microbiota contra doenças inflamatórias intestinais, doenças metabólicas e envelhecimento. O resultado é uma quantidade impressionante de dados, uma verdadeira carteira de identidade da microbiota, batizada de passaporte da microbiota.

Preparação e análise de amostras. Amostras para sequenciamento da microbiota serão coletadas de material fecal e armazenadas em temperatura ultrabaixa (-80°C) para evitar danos à amostra original. O sequenciamento da microbiota será realizado pelo laboratório de Microbiologia da Universidade da Campânia "Luigi Vanvitelli". Para o sequenciamento da microbiota utilizaremos o método "NextGeneration Sequencing" (NGS), que permite o sequenciamento em paralelo de milhões de fragmentos de DNA (25) através do uso da maquinaria Illumina (San Diego, CA). O DNA será extraído dessas amostras usando um procedimento de kit comercial de alta reprodutibilidade (Qiagen, Invitrogen). O rendimento final e a qualidade do DNA extraído serão determinados usando o espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA) e QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). O DNA extraído será amplificado por PCR com os primers: forward: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3' e reverse: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), que tem como alvo a região hipervariável V3 e V4 do 16S gene rRNA. Cada amplificação por PCR será realizada por protocolo para a preparação de bibliotecas 16S para sequenciamento metagenômico (Illumina, San Diego, CA). Os produtos da amplificação serão quantificados pelo fluoreador Qubit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) e agrupados em uma quantidade equimolar de cada amostra com uma concentração final de 2nM. Uma biblioteca de controle Phix (Illumina) será adicionada às amostras. As amostras agrupadas serão sequenciadas na plataforma MiSeq (Illumina, San Diego, CA). Os dados assim obtidos serão submetidos a controles de qualidade por análise bioinformática com FastQC. Por fim, os dados serão analisados ​​de acordo com os testes estatísticos sugeridos pelas diretrizes de sequenciamento metagenômico. Os dados dos pacientes serão comparados entre si e ao longo do tempo com bancos de dados de referência. A avaliação da atividade epigenética da microbiota e das dosagens bioquímicas de citocinas e radicais livres será realizada no laboratório de Farmacologia da Universidade da Campânia "Luigi Vanvitelli. Em particular, para a avaliação da atividade epigenética da microbiota de cada paciente individual hiperglicêmico v/s normoglicêmico com STEMI, procederemos de acordo com o protocolo QIAGEN (Itália) com a extração do material fecal do RNA total, incluindo o baixo -peso um molecular (microRNA). O rendimento final e a qualidade do RNA extraído serão determinados usando o espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA). Através de qRT-PCR (QIAGEN, Itália) serão detectados os níveis de expressão dos seguintes microRNAs fecais: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 e miR-663 envolvido na regulação da microbiota intestinal; miR-10a e miR-18b envolvidos na regulação da microbiota intestinal e inflamação metabólica; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 e miR-223 envolvidos na inflamação metabólica e sinalização de insulina/IGF-1 (26). A atividade metabólica da microbiota em cada paciente hiperglicêmico v/s normoglicêmico individual com STEMI será avaliada pela determinação de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA) de amostras fecais: os níveis de SCFA fecal, um produto da fermentação bacteriana, parecem se correlacionar com uma melhora no diabetes tipo 2 (27). A atividade inflamatória da microbiota será avaliada pela determinação dos níveis fecais de LPS (28-29), IL-1β e IL-6 (30-32), enquanto a atividade oxidativa através da análise dos níveis fecais de ROS, SOD e GSH (33-34).

Acompanhamento O estudo dos autores é projetado para gerenciar pacientes hiperglicêmicos v/s normoglicêmicos com STEMI na "vida real", sem interferência das regras rígidas que limitam a generalização dos RCTs. Portanto, após a alta hospitalar, todos os pacientes serão convidados a realizar as visitas de controle, conforme indicado pelas diretrizes para o manejo de pacientes pós-STEMI (6), na Divisão de Cardiologia da Universidade da Campânia "Luigi Vanvitelli" , e na VI Divisão de Medicina Interna da Universidade "Luigi Vanvitelli" da Campânia. Todos os pacientes serão monitorados por 12 meses após o evento, como acompanhamento, para prática de avaliação clínica (ECG, teste ergométrico, ecocardiograma, níveis de glicose), conforme indicado pelas diretrizes para o manejo de pacientes com IAMCSST (6). Nesses momentos, também serão coletadas amostras de fezes para análise da microbiota. Além disso, na gestão e avaliação da compensação glicémica nos 12 meses de seguimento, o médico também estará envolvido de forma a manter níveis de HbA1c <7%, glicemia entre 90 e 140 mg/dl e glicemia pós-prandial <180 mg /dl.

Desfechos cardiovasculares Os pontos finais cardiovasculares em ambas as coortes incluirão reinfarto do miocárdio, nova hospitalização por doença arterial coronariana (reestenose, implante de stent ou bypass aorto-coronário), insuficiência cardíaca, acidente vascular cerebral, mortalidade cardíaca e todas as causas de mortalidade . O desfecho composto primário consistirá em eventos cardiovasculares, como infarto do miocárdio, hospitalização por insuficiência cardíaca, acidente vascular cerebral ou mortalidade cardíaca. O desfecho secundário consistirá na avaliação da função cardíaca: redução da fração de ejeção, aumento do volume do ventrículo esquerdo, redução da perfusão coronariana. Todas as mortes serão revisadas e classificadas como cardíacas (morte causada por IMA, arritmias ventriculares, insuficiência cardíaca refratária) ou não cardíacas. Todas as revascularizações serão classificadas como precoces (revascularização eletiva até 60 dias após coronariografia) ou tardias. Apenas revascularizações tardias serão classificadas como eventos cardíacos, portanto pacientes com revascularização eletiva precoce serão excluídos da análise.

Análise estatística Os dois grupos serão comparados por meio do teste χ2 de Pearson para variáveis ​​categóricas e do teste de Kruskal-Wallis para variáveis ​​contínuas. As covariáveis ​​candidatas à entrada no modelo multivariado serão identificadas concentrando-se nos fatores que irão diferir significativamente (P valor < 0,05) na análise univariada entre pacientes hiperglicêmicos v/s normoglicêmicos. A regressão de Cox será usada para construir o modelo de mortalidade. O Hazard Ratio para mortalidade será ajustado para idade, IMC, colesterol, LDL, triglicerídeos e terapia com aspirina, ticlopidina, combinação de antiagregantes, β-bloqueadores, inibidores da ECA ou sartans, antidiabéticos, estatinas, durante a hospitalização por STEMI. A análise de sobrevida ao longo do primeiro ano de STEMI será realizada usando a curva de Kaplan-Meier e o método de regressão de Cox. As curvas de mortalidade serão obtidas separadamente para pacientes hiperglicêmicos v/s normoglicemia, para serem comparadas pelo teste de log-rank. Todos os testes serão considerados significativos se valor de p < 0,05. Todas as análises serão realizadas nas duas populações de estudo. Uma análise de "pontuação de propensão" será realizada usando um modelo de regressão logística "não parcimoniosa" que comparará os resultados dos pacientes hiperglicêmicos v / s normoglicêmicos. Mais variáveis ​​serão incluídas no modelo, incluindo idade, sexo, diabetes, hipertensão, hipercolesterolemia, doença multiarterial, insuficiência renal crônica, fluxo TIMI pré-procedimento, fração de ejeção e sucesso do procedimento. O C-score indicará boa discriminação. Com base nas amostras "pareadas", o modelo de risco proporcional de Cox será usado para determinar o impacto da hiperglicemia e da atividade da flora microbiótica na mortalidade durante o seguimento. O SPSS (versão 21, IBM SPSS) será usado para todas as análises.

Tamanho da amostra O tamanho da amostra será calculado com o computador IBM PC pelo software GPOWER. O tamanho do efeito será calculado de acordo com os estudos epidemiológicos e intervencionais realizados em pacientes hiperglicêmicos. O tamanho amostral estimado em um efeito global de 25% com erro tipo I de 0,05 e poder de 95% será de 200 participantes, 100 para o grupo composto por normoglicêmicos e 100 para o grupo de hiperglicêmicos.