Analyse af mikrobiota og STEMI

Hyperglykæmi er et almindeligt fund hos patienter diagnosticeret med akut koronarsyndrom (ACS) og er en uafhængig prædiktor for dødelighed hos patienter med og uden diabetes (1-4). Selvom perkutan koronar intervention (PCI) er hjørnestenen i ST-segment elevation myokardieinfarkt (STEMI) (4-6), er forekomsten af ​​hjertesvigt, re-infarkt og død hos hyperglykæmiske patienter fortsat signifikant med en dødelighed på mere end 40 % et år efter begivenheden (4-5). Faktisk er restenose og no-reflow-fænomener almindelige hændelser, der fører til værre kliniske resultater hos hyperglykæmiske patienter, der gennemgår primær PCI, og resulterer i aterotrombotisk embolisering, øget oxidativt stress og inflammation (3-6). I et forsøg på at modvirke den stigende dødelighed fra hyperglykæmi implementerede koronarenhederne insulinprotokoller for at normalisere blodsukkeret under ACS, og den samme insulinbehandling viste modstridende resultater (7). Data fra små pilotundersøgelser, fra moderate kliniske forsøg og en meta-analyse antydede fordele ved insulinbehandling (1-3,5). På den anden side har efterfølgende randomiserede kliniske forsøg ikke bekræftet en stigning i overlevelse (7, 8). Desuden, hvis den dobbelte anti-aggregationsterapi i øjeblikket er det terapeutiske grundlag for patienter med STEMI behandlet med PCI (9), kan stadig hyppigere anti-aggregationsterapi og blødningsfænomener reducere deres terapeutiske effekt (11-13). Derfor er det sandsynligt, at det individuelle respons på den dobbelte anti-aggregationsterapi og det hyperglykæmiske stress kan påvirke resistensmekanismer og/eller føre til en stigning i farmakologisk funktionel deaktivering af den mikrobiotiske flora. Begrebet mikrobiota angiver helheden af ​​genomerne af mikroorganismer, der befinder sig i en økologisk niche, og som udgør den "menneskelige mikrobiota" (14). I henhold til det analyserede anatomiske område taler vi om tarm-, okulær-, bukkal-, vaginalmikrobiota osv. DNA-analysen af ​​mikroorganismer, der lever i den menneskelige tarmkanal, udført med metagenomiske metoder af MetaHIT-konsortiet, har identificeret over 3 millioner gener, 150 gange dem fra den menneskelige art (16-21). Derudover er hjerte-kar-sygdomme som hypertension og koronararteriesygdom stærkt betinget af tilstedeværelsen af ​​Enterobacteriaceae, Firmicutes og Lattobacilli i tarmen, som kan bestemme deres opståen (22). I denne sammenhæng kunne analysen af ​​den fækale mikrobiota før PCI, ved hospitalsudskrivning og ved opfølgning anses for nyttig til identifikation af hyperglykæmiske patienter med ændring af metaboliske-oxidative processer og pro-trombotiske korrelater med dårligere postprocedureel prognose ( 23 ). Letheden ved at opnå prøver af fækal mikrobiota og den relevante indvirkning på det videnskabelige samfund og på rutinemæssig klinisk praksis, presser os til at insistere på klinisk forskning sammen med en genomisk, metabolisk og cellulær analyse af mikrobiotaen og til at udvinde så meget information som muligt hos hyperglykæmiske patienter med STEMI. Denne undersøgelse er aldrig blevet foreslået i den videnskabelige forskning og kliniske praksis af indlagte hyperglykæmiske patienter for STEMI. Faktisk tyder en stor mængde beviser på, at hyperglykæmi forårsager en stigende produktion af oxidativt stress og inflammation, både i aterosklerotisk plak og i tromben, og derfor spiller det en central rolle i at bestemme værre resultater i STEMI. Derfor kunne analysen af ​​fækal mikrobiota under hændelsen teoretisk identificere hyperglykæmiske patienter med overdreven inflammatorisk og oxidativ tonus forårsaget af hyperglykæmi, konditionerende resistens over for dobbelt anti-aggregationsterapi og koronar stenting og konditionering af protrombotiske fænomener efter koronar reperfusion ved PCI. Derfor vil forfatterne udføre en undersøgelse for at analysere mikrobiotaen hos patienter med akut hyperglykæmisk og normoglykæmisk koronarsyndrom.

MÅL Det primære formål med denne undersøgelse vil være at evaluere eventuelle ændringer i mikrobiotaen og dens aktivitet på fækalt materiale taget før PCI, og efter 6 og 12 måneder hos patienter med hyperglykæmisk STEMI, og også evaluere, om ændringerne i mikrobiotaen kan relateres til 12-måneders prognose.

MATERIALER OG METODER Patienter Dette er et kohortestudie for at undersøge virkningerne af mulige ændringer i mikrobiotaen og dens aktivitet i fæcesprøver taget fra patienter med hyperglykæmisk STEMI v/s normoglykæmisk. Disse patienter behandles i overensstemmelse med rutineprægede terapeutiske praksisser fra "det virkelige liv", vedtaget af Cardiology Division af "Luigi Vanvitelli" University of Campania. Efter udskrivelse fra hospitalet vil alle patienter blive inviteret til at gennemføre kontrolbesøgene, som angivet af retningslinjerne for håndtering af post-STEMI-patienter (6), på Cardiology Division ved Campania University "Luigi Vanvitelli" og kl. VI-afdelingen for intern medicin ved" Luigi Vanvitelli "University of Campania. Alle patienter vil blive overvåget i 12 måneder efter hændelsen som opfølgning. Ifølge den nylige definition af American Heart Association vil hyperglykæmi blive defineret ved fastende blodglykæmiske niveauer > 140 mg/dl (1, 9). Alle patienter med indtræden af ​​symptomer inden for 12 timer og 1 mm forhøjelse af ST-segmentet i 2 eller flere sammenhængende perifere ledninger eller mindst 2 mm i 2 eller flere sammenhængende prækordiale ledninger eller ny indsat venstre grenblok vil blive overvejet for PCI. Inklusionskriterier vil omfatte: alder over 18 og adgang til STEMI første episode. Patienter med venstre ventrikulær ejektionsfraktion <25 %, med tidligere IMA eller tidligere PCI og/eller by-pass vil blive udelukket. Hver vil blive inkluderet i undersøgelsen efter at have underskrevet et informeret samtykke. Rutinemæssig hæmatologisk analyse vil blive udført på tidspunktet for accept, før praktisering af medicinsk terapi og eventuel koronararterieundersøgelse og efter 6 og 12 måneder. På en alikvot af blodprøven taget på disse tidspunkter vil vi evaluere trimethylamin-N-oxid (TMAO), et produkt af bakteriel metabolisme, hvis forhøjede serumniveauer er forbundet med uønskede kardiovaskulære hændelser (24). Derudover vil der inden PCI og 6 og 12 måneder senere blive taget en afføringsprøve, hvorpå mikrobiotaen efterfølgende vil blive analyseret. Forskningen vil blive udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.

Procedure I denne undersøgelse vil forfatterne evaluere en kohorte af patienter med STEMI indlagt på Cardiology Division ved "Luigi Vanvitelli" University of Campania og behandlet med dobbelt anti-aggregerende terapi. Alle patienter vil blive behandlet i henhold til de foreslåede protokoller i de seneste retningslinjer for STEMI (6). Patienter vil blive klassificeret i to grupper: hyperglykæmiske patienter v/s normoglykæmiske, i begge grupper af patienter vil blive udført analyse af den fækale mikrobiota, præ-PCI og præ-dobbelt trombocythæmmende terapi. Mikrobiotaen vil blive ekstraheret fra fækalt materiale og derefter klargjort og efterfølgende analyseret. Det er ikke muligt i klinisk praksis at dyrke langt de fleste tarmbakterier i laboratoriet sammenlignet med den enorme mængde mikroorganismer, der er til stede. Takket være de mest opdaterede teknikker til sekventering af det bakterielle DNA (Next Generation Sequencing) ekstraheret fra fæcesmaterialet, er det nu muligt en fuldstændig og pålidelig identifikation af tarmmikrobiotaen. Ud over at identificere de tilstedeværende bakteriearter er forfattere også i stand til at udtrykke en generel sundhedsgrad af mikrobiotaen (eller dysbiosen), dens effektivitet i produktionen af ​​nogle nyttige eller skadelige stoffer, mikrobiotaens tilstrækkelighed med hensyn til nogle grundlæggende funktioner hvortil er en stedfortræder og tilbøjeligheden af ​​mikrobiotaen selv mod inflammatoriske tarmsygdomme, stofskiftesygdomme og aldring. Resultatet er en imponerende mængde data, et ægte identitetskort for mikrobiotaen, kaldet Microbiota-passet.

Prøveforberedelse og analyse. Prøver til sekventering af mikrobiotaen vil blive indsamlet fra fækalt materiale og opbevaret ved ultralav temperatur (-80°C) for at undgå beskadigelse af den originale prøve. Sekvenseringen af ​​mikrobiotaen vil blive udført af laboratoriet for mikrobiologi ved University of Campania "Luigi Vanvitelli". Til sekventering af mikrobiotaen vil vi bruge "NextGeneration Sequencing" (NGS) metoden, som tillader sekventering parallelt af millioner af DNA-fragmenter (25) gennem brug af Illumina-maskineri (San Diego, CA). DNA'et vil blive ekstraheret fra disse prøver ved hjælp af en kommerciel kitprocedure med høj reproducerbarhed (Qiagen, Invitrogen). Det endelige udbytte og kvalitet af det ekstraherede DNA vil blive bestemt ved hjælp af NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA) og QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). Det ekstraherede DNA vil blive amplificeret ved PCR med primerne: fremad: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 'og omvendt: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), som er målrettet mod den hypervariable region V3 og V4 i 16S. rRNA gen. Hver PCR-amplifikation vil blive udført efter protokol til fremstilling af 16S-biblioteker til metagenomisk sekventering (Illumina, San Diego, CA). Amplifikationsprodukterne vil blive kvantificeret af Qubit fluoridator (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) og grupperet i en ækvimolær mængde af hver prøve med en slutkoncentration på 2nM. Et Phix-kontrolbibliotek (Illumina) vil blive tilføjet til prøverne. De grupperede prøver vil derefter blive sekventeret på MiSeq-platformen (Illumina, San Diego, CA). De således opnåede data vil blive underkastet kvalitetskontrol ved bioinformatikanalyse med FastQC. Til sidst vil dataene blive analyseret i henhold til de statistiske tests foreslået af retningslinjerne for metagenomisk sekventering. Patientdata vil blive sammenlignet med hinanden og over tid med referencedatabaser. Evalueringen af ​​den epigenetiske aktivitet af mikrobiotaen og de biokemiske doser af cytokiner og frie radikaler vil blive udført på laboratoriet for farmakologi ved University of Campania "Luigi Vanvitelli. Specielt for evalueringen af ​​den epigenetiske aktivitet af mikrobiotaen for hver enkelt hyperglykæmisk v/s normoglykæmisk patient med STEMI, vil vi fortsætte i henhold til protokollen QIAGEN (Italien) med ekstraktion fra fæcesmateriale af det totale RNA, inklusive den lave -vægt et molekylært (mikroRNA). Det endelige udbytte og kvaliteten af ​​det ekstraherede RNA vil blive bestemt ved hjælp af NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA). Gennem qRT-PCR (QIAGEN, Italien) vil ekspressionsniveauerne af følgende fækale mikroRNA'er blive detekteret: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 og miR-663 involveret i reguleringen af ​​tarmens mikrobiota; miR-10a og miR-18b involveret i reguleringen af ​​tarmmikrobiota og metabolisk inflammation; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 og miR-223 involveret i metabolisk inflammation og signalering af insulin/IGF-1 (26). Mikrobiotaens metaboliske aktivitet i hver enkelt hyperglykæmisk v/s normoglykæmisk patient med STEMI vil blive evalueret ved bestemmelse af kortkædede fedtsyrer (SCFA) fra fæcesprøver: niveauerne af fækalt SCFA, et produkt af bakteriel fermentering, ser ud til at korrelere med en forbedring af type 2-diabetes (27). Mikrobiotaens inflammatoriske aktivitet vil blive evalueret ved at bestemme de fækale niveauer af LPS (28-29), IL-1β og IL-6 (30-32), mens den oxidative aktivitet gennem analyse af fækale niveauer af ROS, SOD og GSH (33-34).

Follow-up Authors' undersøgelse er designet til at håndtere hyperglykæmiske v/s normoglykæmiske patienter med STEMI i det "virkelige liv", uden indblanding fra de rigide regler, der begrænser generaliserbarheden af ​​RCT'er. Derfor vil alle patienter efter udskrivelse fra hospitalet blive inviteret til at gennemføre kontrolbesøgene, som angivet af retningslinjerne for håndtering af post-STEMI-patienter (6), på Cardiology Division ved Campania University "Luigi Vanvitelli" , og ved VI-afdelingen for intern medicin ved "Luigi Vanvitelli" University of Campania. Alle patienter vil blive monitoreret i 12 måneder efter hændelsen, som opfølgning, for at praktisere klinisk evaluering (EKG, træningstest, ekkokardiogram, glukoseniveauer), som angivet af retningslinjerne for håndtering af STEMI-patienter (6). På disse tidspunkter vil der også blive taget afføringsprøver til analyse af mikrobiotaen. Desuden vil lægen i styringen og vurderingen af ​​den glykæmiske kompensation i de 12 måneders opfølgning også blive inddraget for at opretholde HbA1c-niveauer <7 %, glykæmi mellem 90 og 140 mg/dl og postprandial glykæmi <180 mg / dl.

Kardiovaskulære endepunkter De kardiovaskulære endepunkter i begge kohorter vil omfatte myokardie-re-infarkt, genindlæggelse for koronararteriesygdom (genstenose, stentimplantation eller aorto-koronar bypass), hjertesvigt, slagtilfælde, hjertedødelighed og alle dødelighedsårsager . Det primære sammensatte endepunkt vil bestå af kardiovaskulære hændelser, såsom myokardieinfarkt, hospitalsindlæggelse for hjertesvigt, slagtilfælde eller hjertedødelighed. Det sekundære endepunkt vil bestå i evalueringen af ​​hjertefunktionen: reduktion af ejektionsfraktion, stigning i volumen af ​​venstre ventrikel, reduktion af koronar perfusion. Alle dødsfald vil blive gennemgået og klassificeret som hjerte- (død forårsaget af IMA, ventrikulære arytmier, refraktær hjertesvigt) eller ikke-kardiel. Alle revaskulariseringer vil blive klassificeret som tidlige (elektiv revaskularisering inden for 60 dage efter koronar angiografi) eller sene. Kun sene revaskulariseringer vil blive klassificeret som hjertehændelser, så patienter med tidlig elektiv revaskularisering vil blive udelukket fra analysen.

Statistisk analyse De to grupper vil blive sammenlignet med Pearson χ2-testen for kategoriske variable og Kruskal-Wallis-testen for kontinuerte variable. Kovariatkandidaterne til optagelse i den multivariable model vil blive identificeret ved at koncentrere sig om de faktorer, der vil afvige signifikant (P-værdi <0,05) i den univariate analyse mellem hyperglykæmiske v/s normoglykæmiske patienter. Cox-regression vil blive brugt til at bygge dødelighedsmodellen. Hazard Ratio for dødelighed vil blive justeret for alder, BMI, kolesterol, LDL, triglycerider og aspirinbehandling, ticlopidin, kombination af antiaggreganter, β-blokkere, ACE-hæmmere eller sartaner, antidiabetika, statiner, under indlæggelse for STEMI. Overlevelsesanalyse gennem det første år fra STEMI vil blive udført ved hjælp af Kaplan-Meier-kurven og Cox-regressionsmetoden. Dødelighedskurverne vil blive opnået separat for hyperglykæmiske patienter v/s normoglykæmi, som skal sammenlignes ved hjælp af log-rank test. Alle test vil blive betragtet som signifikante, hvis p-værdi <0,05. Alle analyser vil blive udført i de to undersøgelsespopulationer. En "tilbøjelighedsscore"-analyse vil blive udført ved hjælp af en "ikke sparsom" logistisk regressionsmodel, der vil sammenligne resultaterne af de hyperglykæmiske v/s normoglykæmiske patienter. Flere variabler vil blive inkluderet i modellen, herunder alder, køn, diabetes, hypertension, hyperkolesterolæmi, multikarsygdom, kronisk nyresvigt, TIMI pre-procedure flow, ejektionsfraktion og proceduremæssig succes. C-score vil indikere god diskrimination. Baseret på de "matchede" prøver vil Cox proportional risikomodel blive brugt til at bestemme virkningen af ​​hyperglykæmi og mikrobiotisk floraaktivitet på dødelighed under opfølgning. SPSS (version 21, IBM SPSS) vil blive brugt til alle analyser.

Prøvestørrelse Prøvestørrelsen vil blive beregnet med IBM PC-computer af GPOWER-software. Størrelseseffekten vil blive beregnet i henhold til de epidemiologiske og interventionelle undersøgelser udført på hyperglykæmiske patienter. Prøvestørrelsen estimeret på en global effekt på 25 % med type I fejl på 0,05 og en styrke på 95 % vil være 200 deltagere, 100 for gruppen bestående af normoglykæmiske patienter og 100 for gruppen af ​​hyperglykæmiske patienter.