Analiza mikroflory i STEMI

Hiperglikemia jest częstym objawem u pacjentów z rozpoznaniem ostrego zespołu wieńcowego (ACS) i jest niezależnym predyktorem śmiertelności u pacjentów z cukrzycą i bez cukrzycy (1-4). Chociaż przezskórna interwencja wieńcowa (PCI) jest kamieniem węgielnym zawału mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST (STEMI) (4-6), częstość występowania niewydolności serca, ponownego zawału i śmierci u pacjentów z hiperglikemią pozostaje znaczna, a śmiertelność przekracza 40 % rok po zdarzeniu (4-5). W rzeczywistości restenoza i zjawisko no-reflow są częstymi zdarzeniami prowadzącymi do gorszych wyników klinicznych u pacjentów z hiperglikemią poddawanych pierwotnej PCI i skutkującymi zatorowością miażdżycową, zwiększonym stresem oksydacyjnym i stanem zapalnym (3-6). Próbując przeciwdziałać rosnącej śmiertelności z powodu hiperglikemii, oddziały wieńcowe wdrożyły protokoły insulinowe w celu normalizacji stężenia glukozy we krwi podczas OZW, a to samo leczenie insuliną przyniosło sprzeczne wyniki (7). Dane z małych badań pilotażowych, z umiarkowanych badań klinicznych oraz metaanaliza sugerują korzyści z insulinoterapii (1-3,5). Z drugiej strony kolejne randomizowane badania kliniczne nie potwierdziły wzrostu przeżywalności (7, 8). Co więcej, jeśli dualna terapia antyagregacyjna jest obecnie podstawą terapii pacjentów ze STEMI leczonych PCI (9), to coraz częstsze stosowanie terapii antyagregacyjnej i zjawiska krwawień mogą zmniejszać ich skuteczność terapeutyczną (11-13). Dlatego jest prawdopodobne, że indywidualna reakcja na podwójną terapię antyagregacyjną i stres hiperglikemiczny mogą wpływać na mechanizmy oporności i/lub prowadzić do nasilenia farmakologicznej dezaktywacji czynnościowej przez florę mikrobiotyczną. Termin mikrobiota oznacza całość genomów mikroorganizmów, które znajdują się w niszy ekologicznej i które składają się na „mikrobiom człowieka” (14). W zależności od analizowanego okręgu anatomicznego mówimy o mikrobiocie jelitowej, ocznej, policzkowej, pochwy itp. Analiza DNA mikroorganizmów żyjących w przewodzie pokarmowym człowieka, przeprowadzona metodami metagenomicznymi przez konsorcjum MetaHIT, zidentyfikowała ponad 3 miliony genów, 150 razy więcej niż geny gatunku ludzkiego (16-21). Ponadto choroby sercowo-naczyniowe, takie jak nadciśnienie tętnicze i choroba wieńcowa, są silnie uwarunkowane obecnością w jelicie Enterobacteriaceae, Firmicutes i Lattobacilli, co może determinować ich początek (22). W tym kontekście analiza mikroflory kałowej przed PCI, przy wypisie ze szpitala i w czasie obserwacji może być uważana za przydatną do identyfikacji pacjentów z hiperglikemią ze zmienionymi procesami metaboliczno-oksydacyjnymi, a prozakrzepowe korelacje z gorszym rokowaniem po zabiegu [23]. ). Łatwość uzyskiwania próbek mikroflory kałowej oraz istotny wpływ na społeczność naukową i rutynową praktykę kliniczną skłaniają nas do nalegania na badania kliniczne wraz z analizą genomową, metaboliczną i komórkową mikroflory oraz do wydobywania jak największej ilości możliwie jak najwięcej informacji u pacjentów z hiperglikemią ze STEMI. To badanie nigdy nie było proponowane w badaniach naukowych i praktyce klinicznej u hospitalizowanych pacjentów z hiperglikemią z powodu STEMI. Rzeczywiście, duża liczba dowodów sugeruje, że hiperglikemia powoduje narastającą produkcję stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego, zarówno w blaszce miażdżycowej, jak iw skrzeplinie, a zatem odgrywa kluczową rolę w określaniu gorszych wyników w STEMI. Zatem analiza mikrobioty kałowej podczas zdarzenia mogłaby teoretycznie identyfikować pacjentów z hiperglikemią z nadmiernym napięciem zapalnym i oksydacyjnym spowodowanym hiperglikemią, kondycjonującą opornością na podwójną terapię przeciwagregacyjną i stentowaniem wieńcowym oraz kondycjonującą zjawiska prozakrzepowe po reperfuzji wieńcowej przez PCI. W związku z tym autorzy przeprowadzą badania mające na celu analizę mikrobiomu u pacjentów z ostrym hiperglikemicznym i normoglikemicznym zespołem wieńcowym.

CELE Głównym celem tego badania będzie ocena zmian mikrobiomu i jego aktywności na materiale kałowym pobranym przed PCI oraz po 6 i 12 miesiącach u pacjentów z hiperglikemicznym STEMI, a także ocena, czy zmiany mikrobiomu mogą być związane do 12-miesięcznej prognozy.

MATERIAŁY I METODY Pacjenci Jest to badanie kohortowe mające na celu zbadanie wpływu ewentualnych zmian mikroflory i jej aktywności w próbkach kału pobranych od pacjentów z hiperglikemią STEMI vs normoglikemią. Ci pacjenci są leczeni zgodnie z rutynowymi praktykami terapeutycznymi „z prawdziwego życia”, przyjętymi na Oddziale Kardiologii Uniwersytetu „Luigi Vanvitelli” w Kampanii. Po wypisaniu ze szpitala wszyscy pacjenci zostaną zaproszeni na wizyty kontrolne, zgodnie z wytycznymi postępowania z pacjentami po STEMI (6), na Oddziale Kardiologii Uniwersytetu w Kampanii „Luigi Vanvitelli” oraz w VI Oddział Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu „Luigi Vanvitelli” w Kampanii. Wszyscy pacjenci będą monitorowani przez 12 miesięcy po zdarzeniu, jako kontynuacja. Zgodnie z najnowszą definicją American Heart Association, hiperglikemia będzie definiowana jako poziom glikemii na czczo > 140 mg/dl (1, 9). Wszyscy pacjenci z początkiem objawów w ciągu 12 godzin i uniesieniem odcinka ST o 1 mm w 2 lub więcej przylegających odprowadzeniach obwodowych lub o co najmniej 2 mm w 2 lub więcej przylegających odprowadzeniach przedsercowych lub nowo powstałym bloku lewej odnogi będą brani pod uwagę do wykonania PCI. Kryteria włączenia obejmują: wiek powyżej 18 lat i przyjęcie na pierwszy epizod STEMI. Pacjenci z frakcją wyrzutową lewej komory <25%, po przebytym IMA lub PCI i/lub pomostowaniu będą wykluczeni. Każdy zostanie włączony do badania po podpisaniu świadomej zgody. Rutynowa analiza hematologiczna zostanie przeprowadzona w momencie przyjęcia, przed przystąpieniem do leczenia zachowawczego i ewentualnym badaniem wieńcowym oraz po 6 i 12 miesiącach. Na próbce krwi pobranej w tym czasie ocenimy N-tlenek trimetyloaminy (TMAO), produkt metabolizmu bakteryjnego, którego podwyższone poziomy w surowicy są związane z niepożądanymi zdarzeniami sercowo-naczyniowymi (24). Dodatkowo przed zabiegiem PCI oraz 6 i 12 miesięcy później zostanie pobrana próbka kału, na której następnie zostanie przeanalizowana mikrobiota. Badania będą prowadzone zgodnie z zasadami deklaracji helsińskiej.

Procedura W tym badaniu autorzy ocenią kohortę pacjentów ze STEMI przyjętych na Oddział Kardiologii Uniwersytetu „Luigi Vanvitelli” w Kampanii i leczonych podwójną terapią antyagregacyjną. Wszyscy pacjenci będą leczeni zgodnie z sugerowanymi protokołami zawartymi w najnowszych wytycznych dotyczących STEMI (6). Pacjenci zostaną podzieleni na dwie grupy: pacjenci z hiperglikemią vs/s z normoglikemią, w obu grupach pacjentów zostanie przeprowadzona analiza mikroflory kałowej, przed PCI i przed podwójną terapią przeciwpłytkową. Mikrobiota zostanie wyekstrahowana z materiału kałowego, a następnie przygotowana, a następnie przeanalizowana. W praktyce klinicznej nie jest możliwe wyhodowanie w laboratorium ogromnej większości bakterii jelitowych w porównaniu z ogromną liczbą obecnych mikroorganizmów. Dzięki najnowocześniejszym technikom sekwencjonowania bakteryjnego DNA (Next Generation Sequencing) wyekstrahowanego z materiału kałowego możliwa jest obecnie pełna i wiarygodna identyfikacja mikroflory jelitowej. Oprócz identyfikacji obecnych gatunków bakterii, autorzy są również w stanie wyrazić ogólny stopień zdrowotności mikrobiomu (lub dysbiozy), jego wydajność w produkcji niektórych pożytecznych lub szkodliwych substancji, adekwatność mikrobiomu w odniesieniu do niektórych podstawowych funkcji do którego jest zastępcą i skłonności samej mikrobioty przeciwko nieswoistym zapaleniom jelit, chorobom metabolicznym i procesom starzenia. Rezultatem jest imponująca ilość danych, prawdziwy dowód tożsamości mikrobiomu, zwany paszportem mikrobiomu.

Przygotowanie i analiza próbek. Próbki do sekwencjonowania mikrobiomu będą pobierane z kału i przechowywane w bardzo niskiej temperaturze (-80°C), aby uniknąć uszkodzenia oryginalnej próbki. Sekwencjonowanie mikrobiomu zostanie przeprowadzone przez laboratorium mikrobiologii Uniwersytetu w Kampanii „Luigi Vanvitelli”. Do sekwencjonowania mikrobiomu wykorzystamy metodę „NextGeneration Sequencing” (NGS), która umożliwia równoległe sekwencjonowanie milionów fragmentów DNA (25) przy użyciu maszyn firmy Illumina (San Diego, CA). DNA zostanie wyekstrahowane z tych próbek przy użyciu procedury zestawu komercyjnego o wysokiej odtwarzalności (Qiagen, Invitrogen). Ostateczna wydajność i jakość wyekstrahowanego DNA zostanie określona za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA) i QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). Wyekstrahowany DNA zostanie zamplifikowany metodą PCR ze starterami: do przodu: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3' i do tyłu: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), które celują w region hiperzmienny V3 i V4 16S gen rRNA. Każda amplifikacja PCR zostanie przeprowadzona zgodnie z protokołem przygotowania bibliotek 16S do sekwencjonowania metagenomicznego (Illumina, San Diego, CA). Produkty amplifikacji będą oznaczane ilościowo za pomocą fluoryzatora Qubit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) i grupowane w równomolowej ilości każdej próbki z końcowym stężeniem 2 nM. Do próbek zostanie dodana biblioteka kontrolna Phix (Illumina). Zgrupowane próbki zostaną następnie zsekwencjonowane na platformie MiSeq (Illumina, San Diego, CA). Uzyskane w ten sposób dane zostaną poddane kontroli jakości poprzez analizę bioinformatyczną z FastQC. Na koniec dane zostaną przeanalizowane zgodnie z testami statystycznymi sugerowanymi przez wytyczne dotyczące sekwencjonowania metagenomicznego. Dane pacjentów będą porównywane między sobą iw miarę upływu czasu z referencyjnymi bazami danych. Ocena aktywności epigenetycznej mikrobiomu oraz biochemicznych dawek cytokin i wolnych rodników zostanie przeprowadzona w laboratorium Farmakologii Uniwersytetu w Kampanii „Luigi Vanvitelli. W szczególności, w celu oceny aktywności epigenetycznej mikroflory każdego indywidualnego pacjenta ze STEMI z hiperglikemią vs normoglikemią, będziemy postępować zgodnie z protokołem QIAGEN (Włochy) z ekstrakcją z materiału kałowego całkowitego RNA, w tym niskiego -waga jednej cząsteczki (mikroRNA). Ostateczna wydajność i jakość ekstrahowanego RNA zostanie określona za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA). Za pomocą qRT-PCR (QIAGEN, Włochy) zostaną wykryte poziomy ekspresji następujących mikroRNA w kale: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 i miR-663 bierze udział w regulacji mikroflory jelitowej; miR-10a i miR-18b zaangażowane w regulację mikroflory jelitowej i metabolicznego stanu zapalnego; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 i miR-223 zaangażowane w zapalenie metaboliczne i sygnalizację insuliny/IGF-1 (26). Aktywność metaboliczna mikrobiomu u każdego indywidualnego pacjenta z hiperglikemią i normoglikemią ze STEMI zostanie oceniona poprzez oznaczenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) w próbkach kału: poziomy SCFA w kale, produktu fermentacji bakteryjnej, wydają się korelować z poprawa w cukrzycy typu 2 (27). Aktywność zapalna mikrobiomu zostanie oceniona poprzez oznaczenie w kale poziomu LPS (28-29), IL-1β i IL-6 (30-32), natomiast aktywność oksydacyjna poprzez analizę poziomu w kale ROS, SOD i GSH (33-34).

Badanie kontrolne autorów ma na celu postępowanie z pacjentami ze STEMI z hiperglikemią vs normoglikemią w „prawdziwym życiu”, bez ingerencji ze strony sztywnych zasad, które ograniczają możliwość uogólnienia RCT. Dlatego po wypisaniu ze szpitala wszyscy pacjenci zostaną zaproszeni na wizyty kontrolne, zgodnie z wytycznymi postępowania z pacjentami po STEMI (6), na Oddziale Kardiologii Uniwersytetu w Kampanii „Luigi Vanvitelli” oraz na VI Oddziale Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu „Luigi Vanvitelli” w Kampanii. Wszyscy pacjenci będą monitorowani przez 12 miesięcy po incydencie, jako kontynuacja, w celu praktycznej oceny klinicznej (EKG, próba wysiłkowa, echokardiogram, poziom glukozy), zgodnie z wytycznymi dotyczącymi postępowania z pacjentami ze STEMI (6). W tych punktach czasowych zostaną również pobrane próbki kału do analizy mikroflory. Ponadto w postępowaniu i ocenie wyrównania glikemii w 12-miesięcznej obserwacji lekarz będzie również zaangażowany w celu utrzymania poziomu HbA1c <7%, glikemii między 90 a 140 mg/dl oraz glikemii poposiłkowej <180 mg / dł.

Sercowo-naczyniowe punkty końcowe Do sercowo-naczyniowych punktów końcowych w obu kohortach należeć będzie ponowny zawał mięśnia sercowego, ponowna hospitalizacja z powodu choroby wieńcowej (ponowne zwężenie, implantacja stentu lub pomostowanie aortalno-wieńcowe), niewydolność serca, udar, śmiertelność z przyczyn sercowych i wszystkie przyczyny śmiertelności . Pierwszorzędowy złożony punkt końcowy będzie obejmował zdarzenia sercowo-naczyniowe, takie jak zawał mięśnia sercowego, hospitalizacja z powodu niewydolności serca, udar lub zgon z przyczyn sercowych. Drugorzędowym punktem końcowym będzie ocena funkcji serca: zmniejszenie frakcji wyrzutowej, zwiększenie objętości lewej komory, zmniejszenie perfuzji wieńcowej. Wszystkie zgony zostaną przejrzane i sklasyfikowane jako sercowe (zgony spowodowane przez IMA, komorowe zaburzenia rytmu, oporna na leczenie niewydolność serca) lub niezwiązane z sercem. Wszystkie rewaskularyzacje będą klasyfikowane jako wczesne (rewaskularyzacja planowa w ciągu 60 dni po koronarografii) lub późne. Tylko późne rewaskularyzacje będą klasyfikowane jako incydenty sercowe, więc pacjenci z wczesną planową rewaskularyzacją zostaną wykluczeni z analizy.

Analiza statystyczna Obie grupy zostaną porównane za pomocą testu χ2 Pearsona dla zmiennych kategorialnych oraz testu Kruskala-Wallisa dla zmiennych ciągłych. Współzmienne kandydackie do wejścia do modelu wielozmiennego zostaną zidentyfikowane przez skoncentrowanie się na czynnikach, które będą się istotnie różnić (wartość P <0,05) w analizie jednoczynnikowej między pacjentami z hiperglikemią a pacjentami z normoglikemią. Regresja Coxa zostanie wykorzystana do zbudowania modelu śmiertelności. Współczynnik ryzyka śmiertelności zostanie dostosowany do wieku, BMI, cholesterolu, LDL, trójglicerydów i terapii aspiryną, tiklopidyny, kombinacji leków przeciwagregacyjnych, β-adrenolityków, inhibitorów ACE lub sartanów, leków przeciwcukrzycowych, statyn podczas hospitalizacji z powodu STEMI. Analiza przeżycia do pierwszego roku od STEMI zostanie przeprowadzona przy użyciu krzywej Kaplana-Meiera i metody regresji Coxa. Krzywe śmiertelności zostaną uzyskane oddzielnie dla pacjentów z hiperglikemią w stosunku do normoglikemii, do porównania przy użyciu testu log-rank. Wszystkie testy zostaną uznane za istotne, jeśli wartość p <0,05. Wszystkie analizy zostaną przeprowadzone w dwóch badanych populacjach. Analiza „propensity score” zostanie przeprowadzona przy użyciu „nieoszczędnego” modelu regresji logistycznej, który porówna wyniki pacjentów z hiperglikemią i normoglikemią. W modelu zostanie uwzględnionych więcej zmiennych, w tym wiek, płeć, cukrzyca, nadciśnienie, hipercholesterolemia, choroba wielonaczyniowa, przewlekła niewydolność nerek, przepływ przed zabiegiem TIMI, frakcja wyrzutowa i sukces zabiegu. Wynik C będzie wskazywał na dobrą dyskryminację. W oparciu o „dopasowane” próbki model proporcjonalnego ryzyka Coxa zostanie wykorzystany do określenia wpływu hiperglikemii i aktywności flory bakteryjnej na śmiertelność podczas obserwacji. SPSS (wersja 21, IBM SPSS) będzie używany do wszystkich analiz.

Wielkość próbki Wielkość próbki zostanie obliczona na komputerze IBM PC przez oprogramowanie GPOWER. Efekt wielkości zostanie obliczony na podstawie badań epidemiologicznych i interwencyjnych przeprowadzonych na pacjentach z hiperglikemią. Wielkość próby oszacowana na podstawie globalnego efektu 25% z błędem typu I 0,05 i mocą 95% wyniesie 200 uczestników, 100 dla grupy pacjentów z normoglikemią i 100 dla grupy pacjentów z hiperglikemią.