Analys av mikrobiotan och STEMI

Hyperglykemi är ett vanligt fynd hos patienter med diagnosen akut koronarsyndrom (ACS) och är en oberoende prediktor för dödlighet hos patienter med och utan diabetes (1-4). Även om perkutan kranskärlsintervention (PCI) är hörnstenen i hjärtinfarkt med ST-förhöjning (STEMI) (4-6), är förekomsten av hjärtsvikt, återinfarkt och död hos hyperglykemiska patienter fortfarande betydande, med en dödlighet på mer än 40 % ett år efter händelsen (4-5). Faktum är att restenos och inga återflödesfenomen är vanliga händelser som leder till sämre kliniska resultat, hos hyperglykemiska patienter som genomgår primär PCI, och som resulterar i aterotrombotisk embolisering, ökad oxidativ stress och inflammation (3-6). I ett försök att motverka den ökade dödligheten från hyperglykemi, implementerade kranskärlsenheterna insulinprotokoll för att normalisera blodsockret under ACS, och samma insulinbehandling visade motstridiga resultat (7). Data från små pilotstudier, från måttliga kliniska prövningar och en metaanalys antydde fördelar med insulinbehandling (1-3,5). Å andra sidan har efterföljande randomiserade kliniska prövningar inte bekräftat en ökning av överlevnaden (7, 8). Dessutom, om den dubbla anti-aggregationsterapin för närvarande är den terapeutiska basen för patienter med STEMI som behandlas med PCI (9), kan allt oftare antiaggregationsterapi och blödningsfenomen minska deras terapeutiska effekt (11-13). Därför är det troligt att det individuella svaret på den dubbla anti-aggregationsterapin, och den hyperglykemiska stressen, kan påverka resistensmekanismer och/eller leda till en ökning av farmakologisk funktionell deaktivering av den mikrobiotiska floran. Termen mikrobiota indikerar helheten av genomen hos mikroorganismer som finns i en ekologisk nisch och som utgör den "mänskliga mikrobiotan" (14). Enligt det analyserade anatomiska området talar vi om intestinal, okulär, buckal, vaginal mikrobiota, etc. DNA-analysen av mikroorganismer som lever i människans tarmkanal, utförd med metagenomiska metoder av MetaHIT-konsortiet, har identifierat över 3 miljoner gener, 150 gånger de hos den mänskliga arten (16-21). Dessutom är hjärt-kärlsjukdomar som högt blodtryck och kranskärlssjukdom starkt betingade av närvaron av Enterobacteriaceae, Firmicutes och Lattobacilli i tarmen, vilket kan avgöra deras uppkomst (22). I detta sammanhang kan analysen av den fekala mikrobiotan före PCI, vid utskrivning från sjukhus och vid uppföljning anses användbar för att identifiera hyperglykemiska patienter med förändring av metaboliska-oxidativa processer, och protrombotiska korrelationer med sämre postprognos ( 23 ). Lättheten att erhålla prover av fekal mikrobiota, och den relevanta inverkan på vetenskapssamhället och på rutinmässig klinisk praxis, driver oss att insistera på klinisk forskning, tillsammans med en genomisk, metabolisk och cellulär analys av mikrobiotan, och att extrahera så mycket information som möjligt hos hyperglykemiska patienter med STEMI. Denna undersökning har aldrig föreslagits i vetenskaplig forskning och klinisk praxis av sjukhusinlagda hyperglykemiska patienter för STEMI. Faktum är att en stor mängd bevis tyder på att hyperglykemi orsakar en ökande produktion av oxidativ stress och inflammation, både i aterosklerotiskt plack och i tromben, och därför spelar det en central roll för att bestämma sämre resultat vid STEMI. Därför kan analysen av avföringsmikrobiota under händelsen teoretiskt identifiera hyperglykemiska patienter med överdriven inflammatorisk och oxidativ tonus orsakad av hyperglykemi, konditionerande resistens mot dubbel anti-aggregationsterapi och koronar stenting, och konditionerande protrombotiska fenomen efter koronar reperfusion av PCI. Därför kommer författarna att genomföra en studie för att analysera mikrobiotan hos patienter med akut hyperglykemiskt och normoglykemiskt koronarsyndrom.

MÅL Det primära syftet med denna studie kommer att vara att utvärdera eventuella förändringar i mikrobiotan och dess aktivitet på fekalt material taget före PCI och efter 6 och 12 månader hos patienter med hyperglykemiskt STEMI, och även utvärdera om förändringarna i mikrobiotan kan relateras till 12-månadersprognosen.

MATERIAL OCH METODER Patienter Detta är en kohortstudie för att undersöka effekterna av eventuella förändringar i mikrobiotan och dess aktivitet i fekala prover tagna från patienter med hyperglykemiskt STEMI v/s normoglykemiskt. Dessa patienter behandlas enligt rutinmässiga "verkliga" terapeutiska metoder, antagna vid kardiologiavdelningen vid "Luigi Vanvitelli" University of Campania. Efter utskrivning från sjukhuset kommer alla patienter att bjudas in att genomföra kontrollbesöken, enligt riktlinjerna för hantering av post-STEMI-patienter (6), vid kardiologiavdelningen vid Campanias universitet "Luigi Vanvitelli" och kl. VI-avdelningen för internmedicin vid" Luigi Vanvitelli "University of Campania. Alla patienter kommer att övervakas i 12 månader efter händelsen, som en uppföljning. Enligt den senaste definitionen av American Heart Association kommer hyperglykemi att definieras av fastande blodglykemiska nivåer > 140 mg/dl (1, 9). Alla patienter med debut av symtom inom 12 timmar och 1 mm förhöjning av ST-segmentet i 2 eller fler sammanhängande perifera avledningar eller minst 2 mm i 2 eller fler sammanhängande prekordiala avledningar eller nystartad vänstergrenblock kommer att övervägas för PCI. Inklusionskriterier kommer att inkludera: ålder över 18 och antagning för STEMI första avsnitt. Patienter med vänsterkammars ejektionsfraktion <25 %, med tidigare IMA eller tidigare PCI och/eller bypass kommer att exkluderas. Var och en kommer att inkluderas i studien efter att ha undertecknat ett informerat samtycke. Rutinmässig hematologisk analys kommer att utföras vid tidpunkten för acceptans, före utövande av medicinsk terapi och eventuell kranskärlsundersökning och efter 6 och 12 månader. På en alikvot av blodprovet som tagits vid dessa tidpunkter kommer vi att utvärdera trimetylamin-N-oxid (TMAO), en produkt av bakteriell metabolism, vars förhöjda serumnivåer är associerade med biverkningar av kardiovaskulära händelser (24). Dessutom, innan PCI, och 6 och 12 månader senare, kommer ett avföringsprov att tas på vilket mikrobiotan sedan analyseras. Forskningen kommer att bedrivas i enlighet med principerna i Helsingforsdeklarationen.

Tillvägagångssätt I denna studie kommer författarna att utvärdera en kohort av patienter med STEMI som tagits in på Cardiology Division vid "Luigi Vanvitelli" University of Campania, och som behandlas med dubbel anti-aggregerande terapi. Alla patienter kommer att behandlas enligt de föreslagna protokollen i de senaste riktlinjerna för STEMI (6). Patienter kommer att klassificeras i två grupper: hyperglykemiska patienter v/s normoglykemiska, i båda grupperna av patienter kommer att utföras analys av den fekala mikrobiotan, pre PCI och pre-dual antitrombocytterapi. Mikrobiotan kommer att extraheras från fekalt material och sedan prepareras och analyseras därefter. Det är inte möjligt i klinisk praxis att odla de allra flesta tarmbakterier i laboratoriet, jämfört med den enorma mängden mikroorganismer som finns. Tack vare de mest uppdaterade teknikerna för sekvensering av bakteriens DNA (Next Generation Sequencing) som extraherats från fekalt material, är det nu möjligt en fullständig och tillförlitlig identifiering av tarmmikrobiotan. Förutom att identifiera de bakteriearter som finns, kan författarna också uttrycka en övergripande hälsograd av mikrobiotan (eller dysbios), dess effektivitet i produktionen av några användbara eller skadliga ämnen, mikrobiotans tillräcklighet med avseende på några grundläggande funktioner till vilken är en ställföreträdare och själva mikrobiotans benägenhet mot inflammatoriska tarmsjukdomar, metabola sjukdomar och åldrande. Resultatet är en imponerande mängd data, ett sant identitetskort för mikrobiotan, kallat Microbiota-passet.

Provberedning och analys. Prover för sekvensering av mikrobiotan kommer att samlas in från fekalt material och förvaras vid ultralåg temperatur (-80°C) för att undvika skador på originalprovet. Sekvenseringen av mikrobiotan kommer att utföras av laboratoriet för mikrobiologi vid Campanias universitet "Luigi Vanvitelli". För sekvensering av mikrobiotan kommer vi att använda metoden "NextGeneration Sequencing" (NGS), som möjliggör parallell sekvensering av miljontals DNA-fragment (25) genom användning av Illumina-maskineri (San Diego, CA). DNA:t kommer att extraheras från dessa prover med hjälp av en kommersiell kitprocedur med hög reproducerbarhet (Qiagen, Invitrogen). Det slutliga utbytet och kvaliteten på det extraherade DNA:t kommer att bestämmas med hjälp av NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA) och QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). Det extraherade DNA:t kommer att amplifieras med PCR med primrarna: framåt: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 'och omvänt: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), som riktar sig mot den hypervariabla regionen V3 och V4 i 16S rRNA-genen. Varje PCR-amplifiering kommer att utföras enligt protokoll för beredning av 16S-bibliotek för metagenomisk sekvensering (Illumina, San Diego, CA). Amplifieringsprodukterna kommer att kvantifieras av Qubit fluoridator (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) och grupperas i en ekvimolär mängd av varje prov med en slutlig koncentration på 2nM. Ett Phix-kontrollbibliotek (Illumina) kommer att läggas till proverna. De grupperade proverna kommer sedan att sekvenseras på MiSeq-plattformen (Illumina, San Diego, CA). De data som sålunda erhålls kommer att bli föremål för kvalitetskontroller genom bioinformatikanalys med FastQC. Slutligen kommer data att analyseras enligt de statistiska tester som föreslås av riktlinjerna för metagenomisk sekvensering. Patientdata kommer att jämföras med varandra och över tid med referensdatabaser. Utvärderingen av den epigenetiska aktiviteten hos mikrobiotan och de biokemiska doserna av cytokiner och fria radikaler kommer att utföras på laboratoriet för farmakologi vid universitetet i Campania "Luigi Vanvitelli. I synnerhet för utvärderingen av den epigenetiska aktiviteten hos mikrobiotan hos varje enskild hyperglykemisk v/s normoglykemisk patient med STEMI, kommer vi att fortsätta enligt protokollet QIAGEN (Italien) med extraktion från fekalt material av det totala RNA:t, inklusive det låga -vikt en molekylär (mikroRNA). Det slutliga utbytet och kvaliteten på det extraherade RNA:t kommer att bestämmas med hjälp av NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (ThermoScientific, Waltham, MA). Genom qRT-PCR (QIAGEN, Italien) kommer expressionsnivåerna av följande fekala mikroRNA att detekteras: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 och miR-663 involverad i regleringen av tarmens mikrobiota; miR-10a och miR-18b involverade i regleringen av tarmmikrobiota och metabolisk inflammation; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 och miR-223 involverade i metabolisk inflammation och signalering av insulin/IGF-1 (26). Mikrobiotans metaboliska aktivitet hos varje enskild hyperglykemisk v/s normoglykemisk patient med STEMI kommer att utvärderas genom bestämning av kortkedjiga fettsyror (SCFA) från fekala prover: nivåerna av fekal SCFA, en produkt av bakteriell fermentering, verkar korrelera med en förbättring av typ 2-diabetes (27). Mikrobiotans inflammatoriska aktivitet kommer att utvärderas genom att bestämma de fekala nivåerna av LPS (28-29), IL-1β och IL-6 (30-32), medan den oxidativa aktiviteten genom analys av fekala nivåer av ROS, SOD och GSH (33-34).

Uppföljning Författarnas studie är utformad för att hantera hyperglykemiska v/s normoglykemiska patienter med STEMI i "verkliga livet", utan inblandning från de stela regler som begränsar generaliserbarheten av RCT. Därför, efter utskrivning från sjukhuset, kommer alla patienter att bjudas in att genomföra kontrollbesöken, enligt riktlinjerna för hantering av post-STEMI-patienter (6), vid kardiologiavdelningen vid Campanias universitet "Luigi Vanvitelli" , och vid VI-avdelningen för internmedicin vid universitetet "Luigi Vanvitelli" i Kampanien. Alla patienter kommer att övervakas i 12 månader efter händelsen, som uppföljning, för att utföra klinisk utvärdering (EKG, ansträngningstest, ekokardiogram, glukosnivåer), enligt riktlinjerna för hantering av STEMI-patienter (6). Vid dessa tidpunkter kommer även avföringsprover att tas för analys av mikrobiotan. Dessutom, i hanteringen och bedömningen av den glykemiska kompensationen under de 12 månaderna av uppföljning, kommer läkaren också att involveras för att bibehålla HbA1c-nivåer <7 %, glykemi mellan 90 och 140 mg/dl och postprandial glykemi <180 mg /dl.

Kardiovaskulära ändpunkter De kardiovaskulära ändpunkterna i båda kohorterna kommer att inkludera hjärtinfarkt, återinläggning för kranskärlssjukdom (återstenos, stentimplantation eller aorto-koronar bypass), hjärtsvikt, stroke, hjärtmortalitet och alla dödsorsaker . Den primära sammansatta slutpunkten kommer att bestå av kardiovaskulära händelser, såsom hjärtinfarkt, sjukhusvistelse för hjärtsvikt, stroke eller hjärtmortalitet. Den sekundära slutpunkten kommer att bestå i utvärderingen av hjärtfunktionen: minskning av ejektionsfraktion, ökning av volymen av vänster kammare, minskning av kranskärlsperfusion. Alla dödsfall kommer att granskas och klassificeras som hjärt (död orsakad av IMA, ventrikulära arytmier, refraktär hjärtsvikt) eller icke-kardiell. Alla revaskulariseringar kommer att klassificeras som tidiga (elektiv revaskularisering inom 60 dagar efter koronarangiografi) eller sena. Endast sena revaskulariseringar kommer att klassificeras som hjärthändelser, så patienter med tidig elektiv revaskularisering kommer att exkluderas från analysen.

Statistisk analys De två grupperna kommer att jämföras med Pearson χ2-testet för kategoriska variabler och Kruskal-Wallis-testet för kontinuerliga variabler. Kovariatkandidaterna för inträde i den multivariabla modellen kommer att identifieras genom att koncentrera sig på de faktorer som kommer att skilja sig signifikant (P-värde <0,05) i den univariata analysen mellan hyperglykemiska v/s normoglykemiska patienter. Cox-regression kommer att användas för att bygga dödlighetsmodellen. Hazard Ratio för dödlighet kommer att justeras för ålder, BMI, kolesterol, LDL, triglycerider och aspirinbehandling, tiklopidin, kombination av antiaggreganter, β-blockerare, ACE-hämmare eller sartaner, antidiabetika, statiner, under sjukhusvistelse för STEMI. Överlevnadsanalys genom det första året från STEMI kommer att utföras med Kaplan-Meier-kurvan och Cox-regressionsmetoden. Mortalitetskurvorna kommer att erhållas separat för hyperglykemiska patienter v/s normoglykemi, för att jämföras med hjälp av log-rank test. Alla tester kommer att anses vara signifikanta om p-värdet <0,05. Alla analyser kommer att utföras i de två studiepopulationerna. En "benägenhetspoäng"-analys kommer att utföras med hjälp av en "icke sparsam" logistisk regressionsmodell som kommer att jämföra resultaten för de hyperglykemiska v/s normoglykemiska patienterna. Fler variabler kommer att inkluderas i modellen inklusive ålder, kön, diabetes, hypertoni, hyperkolesterolemi, multikärlsjukdom, kronisk njursvikt, TIMI-flöde före proceduren, ejektionsfraktion och procedurframgång. C-poängen kommer att indikera god diskriminering. Baserat på de "matchade" proverna kommer Cox proportionella riskmodell att användas för att bestämma effekten av hyperglykemi och mikrobiotisk floraaktivitet på dödligheten under uppföljningen. SPSS (version 21, IBM SPSS) kommer att användas för alla analyser.

Provstorlek Provstorleken kommer att beräknas med IBM PC-dator med GPOWER-programvara. Storlekseffekten kommer att beräknas enligt de epidemiologiska och interventionella studierna som utförs på hyperglykemiska patienter. Urvalsstorleken uppskattad på en global effekt på 25 % med typ I-fel på 0,05 och en styrka på 95 % kommer att vara 200 deltagare, 100 för gruppen bestående av normoglykemiska patienter och 100 för gruppen hyperglykemiska patienter.