Analyse der Mikrobiota und STEMI

Hyperglykämie ist ein häufiger Befund bei Patienten, bei denen ein akutes Koronarsyndrom (ACS) diagnostiziert wurde, und ist ein unabhängiger Prädiktor für die Mortalität bei Patienten mit und ohne Diabetes (1-4). Obwohl die perkutane Koronarintervention (PCI) der Eckpfeiler des ST-Strecken-Hebungs-Myokardinfarkts (STEMI) (4-6) ist, bleibt die Inzidenz von Herzinsuffizienz, Reinfarkt und Tod bei hyperglykämischen Patienten mit einer Mortalität von mehr als 40 signifikant % ein Jahr nach dem Ereignis (4-5). Tatsächlich sind Restenose und No-Reflow-Phänomene häufige Ereignisse, die bei hyperglykämischen Patienten, die sich einer primären PCI unterziehen, zu schlechteren klinischen Ergebnissen führen und zu atherothrombotischer Embolisation, erhöhtem oxidativem Stress und Entzündungen führen (3-6). In einem Versuch, der zunehmenden Sterblichkeit durch Hyperglykämie entgegenzuwirken, implementierten die Koronarstationen Insulinprotokolle, um den Blutzucker während ACS zu normalisieren, und dieselbe Insulinbehandlung zeigte widersprüchliche Ergebnisse (7). Daten aus kleinen Pilotstudien, moderaten klinischen Studien und einer Metaanalyse deuten auf Vorteile einer Insulintherapie hin (1-3,5). Andererseits haben spätere randomisierte klinische Studien keine Verlängerung der Überlebenszeit bestätigt (7, 8) . Wenn außerdem die duale Antiaggregationstherapie derzeit die therapeutische Grundlage von Patienten mit STEMI ist, die mit PCI behandelt werden (9), können eine zunehmend häufigere Antiaggregationstherapie und Blutungsphänomene ihre therapeutische Wirksamkeit verringern (11–13). Daher ist es wahrscheinlich, dass die individuelle Reaktion auf die duale Antiaggregationstherapie und der hyperglykämische Stress Resistenzmechanismen beeinflussen und/oder zu einer Zunahme der pharmakologischen funktionellen Deaktivierung durch die mikrobiotische Flora führen können. Der Begriff Mikrobiota bezeichnet die Gesamtheit der Genome von Mikroorganismen, die in einer ökologischen Nische angesiedelt sind und die „menschliche Mikrobiota“ darstellen (14). Entsprechend dem analysierten anatomischen Bezirk sprechen wir von intestinaler, okulärer, bukkaler, vaginaler Mikrobiota usw. Die DNA-Analyse von Mikroorganismen, die im menschlichen Darmtrakt leben, die mit metagenomischen Methoden vom MetaHIT-Konsortium durchgeführt wurde, hat über 3 Millionen Gene identifiziert, 150-mal so viele wie die der menschlichen Spezies (16-21). Darüber hinaus werden Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Bluthochdruck und koronare Herzkrankheit stark durch das Vorhandensein von Enterobacteriaceae, Firmicutes und Lattobazillen im Darm bedingt, die ihren Ausbruch bestimmen können (22). In diesem Zusammenhang könnte die Analyse der fäkalen Mikrobiota vor der PCI, bei der Krankenhausentlassung und bei der Nachsorge als nützlich angesehen werden, um hyperglykämische Patienten mit Veränderungen der metabolisch-oxidativen Prozesse zu identifizieren, und prothrombotische Korrelationen mit einer schlechteren Prognose nach dem Eingriff (23 ). Die Leichtigkeit, Proben von fäkalen Mikrobiota zu erhalten, und die entsprechenden Auswirkungen auf die wissenschaftliche Gemeinschaft und auf die klinische Routinepraxis, veranlassen uns, auf klinischer Forschung zusammen mit einer genomischen, metabolischen und zellulären Analyse der Mikrobiota zu bestehen und so viel zu extrahieren Informationen wie möglich bei hyperglykämischen Patienten mit STEMI. Diese Untersuchung wurde in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis von hospitalisierten hyperglykämischen Patienten für STEMI nie vorgeschlagen. In der Tat deutet eine große Menge an Beweisen darauf hin, dass Hyperglykämie eine zunehmende Produktion von oxidativem Stress und Entzündungen sowohl in atherosklerotischen Plaques als auch im Thrombus verursacht und daher eine zentrale Rolle bei der Bestimmung schlechterer Ergebnisse bei STEMI spielt. Daher könnte die Analyse der fäkalen Mikrobiota während der Veranstaltung theoretisch hyperglykämische Patienten mit übermäßigem entzündlichen und oxidativen Tonus identifizieren, der durch Hyperglykämie, konditionierende Resistenz gegen doppelte Antiaggregationstherapie und Koronarstent und konditionierende prothrombotische Phänomene nach Koronarreperfusion durch PCI verursacht wird. Daher werden die Autoren eine Studie zur Analyse der Mikrobiota bei Patienten mit akutem hyperglykämischem und normoglykämischem Koronarsyndrom durchführen.

ZIELE Das Hauptziel dieser Studie besteht darin, alle Veränderungen der Mikrobiota und ihrer Aktivität auf Stuhlmaterial zu bewerten, das vor der PCI und nach 6 und 12 Monaten bei Patienten mit hyperglykämischem STEMI entnommen wurde, und auch zu bewerten, ob die Veränderungen der Mikrobiota zusammenhängen können zur 12-Monats-Prognose.

MATERIAL UND METHODEN Patienten Dies ist eine Kohortenstudie zur Untersuchung der Auswirkungen möglicher Veränderungen der Mikrobiota und ihrer Aktivität in Stuhlproben von Patienten mit hyperglykämischem STEMI vs. normoglykämischem. Diese Patienten werden nach routinemäßigen therapeutischen Praktiken aus dem "echten Leben" behandelt, die in der Abteilung für Kardiologie der Universität "Luigi Vanvitelli" in Kampanien übernommen wurden. Nach der Entlassung aus dem Krankenhaus werden alle Patienten eingeladen, die Kontrollbesuche, wie in den Richtlinien für die Behandlung von Post-STEMI-Patienten (6) angegeben, in der Abteilung für Kardiologie der Universität von Kampanien „Luigi Vanvitelli“ und bei durchzuführen die VI Abteilung für Innere Medizin der "Luigi Vanvitelli" Universität von Kampanien. Alle Patienten werden für 12 Monate nach dem Ereignis als Nachsorge überwacht. Nach der aktuellen Definition der American Heart Association wird eine Hyperglykämie durch Nüchternblutzuckerwerte > 140 mg/dl definiert (1, 9). Alle Patienten mit Beginn der Symptome innerhalb von 12 Stunden und 1 mm Hebung der ST-Strecke in 2 oder mehr zusammenhängenden peripheren Ableitungen oder mindestens 2 mm in 2 oder mehr zusammenhängenden präkordialen Ableitungen oder neu einsetzendem Linksastblock werden für PCI in Betracht gezogen. Zu den Aufnahmekriterien gehören: Alter über 18 Jahre und Zulassung für die erste STEMI-Episode. Patienten mit einer linksventrikulären Ejektionsfraktion < 25 %, mit vorheriger IMA oder vorheriger PCI und/oder Bypass werden ausgeschlossen. Jeder wird nach Unterzeichnung einer Einverständniserklärung in die Studie aufgenommen. Routinemäßige hämatologische Analysen werden zum Zeitpunkt der Aufnahme, vor der Durchführung einer medizinischen Therapie und einer möglichen Koronararterienuntersuchung sowie nach 6 und 12 Monaten durchgeführt. An einem Aliquot der zu diesen Zeiten entnommenen Blutprobe werten wir Trimethylamin-N-oxid (TMAO) aus, ein Produkt des bakteriellen Stoffwechsels, dessen erhöhte Serumspiegel mit unerwünschten kardiovaskulären Ereignissen assoziiert sind (24). Zusätzlich wird vor der PCI sowie 6 und 12 Monate später eine Stuhlprobe entnommen, an der anschließend die Mikrobiota analysiert wird. Die Forschung wird in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

Verfahren In dieser Studie werden die Autoren eine Kohorte von Patienten mit STEMI bewerten, die in die Abteilung für Kardiologie der „Luigi Vanvitelli“-Universität Kampanien aufgenommen und mit einer dualen Antiaggregationstherapie behandelt wurden. Alle Patienten werden gemäß den vorgeschlagenen Protokollen der neuesten Richtlinien zu STEMI (6) behandelt. Die Patienten werden in zwei Gruppen eingeteilt: hyperglykämische Patienten vs. normoglykämische Patienten, in beiden Patientengruppen wird eine Analyse der fäkalen Mikrobiota durchgeführt, vor der PCI und vor der dualen Thrombozytenaggregationshemmung. Die Mikrobiota wird aus Fäkalien extrahiert, aufbereitet und anschließend analysiert. Es ist in der klinischen Praxis nicht möglich, die überwiegende Mehrheit der Darmbakterien im Labor zu kultivieren, verglichen mit der enormen Menge an vorhandenen Mikroorganismen. Dank modernster Techniken zur Sequenzierung der aus dem Kot extrahierten bakteriellen DNA (Next Generation Sequencing) ist heute eine vollständige und zuverlässige Identifizierung der Darmmikrobiota möglich. Neben der Identifizierung der vorhandenen Bakterienarten sind die Autoren auch in der Lage, einen allgemeinen Gesundheitszustand der Mikrobiota (oder Dysbiose), ihre Effizienz bei der Produktion einiger nützlicher oder schädlicher Substanzen und die Angemessenheit der Mikrobiota in Bezug auf einige grundlegende Funktionen auszudrücken dazu ein Stellvertreter und die Neigung der Mikrobiota selbst gegen entzündliche Darmerkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und Alterung. Das Ergebnis ist eine beeindruckende Datenmenge, ein echter Ausweis der Mikrobiota, genannt Mikrobiota-Pass.

Probenvorbereitung und Analyse. Proben zur Sequenzierung der Mikrobiota werden aus Fäkalien entnommen und bei ultraniedriger Temperatur (-80 °C) gelagert, um Schäden an der Originalprobe zu vermeiden. Die Sequenzierung der Mikrobiota wird vom Labor für Mikrobiologie der Universität Kampanien „Luigi Vanvitelli“ durchgeführt. Für die Sequenzierung der Mikrobiota werden wir die "NextGeneration Sequencing" (NGS)-Methode verwenden, die die parallele Sequenzierung von Millionen von DNA-Fragmenten (25) durch den Einsatz von Illumina-Maschinen (San Diego, CA) ermöglicht. Die DNA wird aus diesen Proben unter Verwendung eines kommerziellen Kit-Verfahrens mit hoher Reproduzierbarkeit (Qiagen, Invitrogen) extrahiert. Die endgültige Ausbeute und Qualität der extrahierten DNA wird mit dem NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer (ThermoScientific, Waltham, MA) und dem QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) bestimmt. Die extrahierte DNA wird durch PCR mit den Primern amplifiziert: vorwärts: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3' und rückwärts: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), die auf die hypervariable Region V3 und V4 des 16S abzielen rRNA-Gen. Jede PCR-Amplifikation wird gemäß dem Protokoll zur Herstellung von 16S-Bibliotheken für die metagenomische Sequenzierung (Illumina, San Diego, CA) durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte werden mit dem Qubit-Fluoridator (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) quantifiziert und in einer äquimolaren Menge jeder Probe mit einer Endkonzentration von 2 nM gruppiert. Den Proben wird eine Phix-Steuerungsbibliothek (Illumina) hinzugefügt. Die gruppierten Proben werden dann auf der MiSeq-Plattform (Illumina, San Diego, CA) sequenziert. Die so gewonnenen Daten werden einer Qualitätskontrolle durch bioinformatische Analysen mit FastQC unterzogen. Schließlich werden die Daten gemäß den statistischen Tests analysiert, die von den Richtlinien für die metagenomische Sequenzierung vorgeschlagen werden. Patientendaten werden untereinander und im Zeitverlauf mit Referenzdatenbanken abgeglichen. Die Bewertung der epigenetischen Aktivität der Mikrobiota und der biochemischen Dosierungen von Zytokinen und freien Radikalen wird im Labor für Pharmakologie der Universität Kampanien „Luigi Vanvitelli“ durchgeführt. Insbesondere zur Bewertung der epigenetischen Aktivität der Mikrobiota jedes einzelnen hyperglykämischen vs. normoglykämischen Patienten mit STEMI werden wir gemäß dem Protokoll von QIAGEN (Italien) mit der Extraktion der Gesamt-RNA aus Fäkalmaterial, einschließlich der niedrigen, fortfahren -Gewicht ein Molekül (microRNA). Die endgültige Ausbeute und Qualität der extrahierten RNA wird unter Verwendung des Spektrophotometers NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA) bestimmt. Durch qRT-PCR (QIAGEN, Italien) werden die Expressionsniveaus der folgenden fäkalen microRNAs nachgewiesen: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 und miR-663 an der Regulation der Darmmikrobiota beteiligt; miR-10a und miR-18b, die an der Regulierung der Darmmikrobiota und metabolischen Entzündungen beteiligt sind; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 und miR-223 sind an metabolischen Entzündungen beteiligt und signalisieren Insulin/IGF-1 (26). Die metabolische Aktivität der Mikrobiota bei jedem einzelnen hyperglykämischen vs. normoglykämischen Patienten mit STEMI wird durch die Bestimmung von kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) aus Stuhlproben bewertet: Die Konzentrationen von fäkalem SCFA, einem Produkt bakterieller Fermentation, scheinen damit zu korrelieren eine Verbesserung bei Typ-2-Diabetes (27). Die entzündliche Aktivität der Mikrobiota wird durch Bestimmung der fäkalen Spiegel von LPS (28-29), IL-1β und IL-6 (30-32) bewertet, während die oxidative Aktivität durch die Analyse der fäkalen Spiegel von ROS, SOD u GSH (33-34).

Follow-up Die Studie der Autoren ist darauf ausgelegt, hyperglykämische vs. normoglykämische Patienten mit STEMI im „realen Leben“ zu behandeln, ohne durch die starren Regeln beeinträchtigt zu werden, die die Verallgemeinerbarkeit von RCTs einschränken. Daher werden alle Patienten nach der Entlassung aus dem Krankenhaus eingeladen, die Kontrollbesuche, wie in den Richtlinien für die Behandlung von Post-STEMI-Patienten (6) angegeben, in der Abteilung für Kardiologie der Universität von Kampanien „Luigi Vanvitelli“ durchzuführen. , und an der VI. Abteilung für Innere Medizin der Universität "Luigi Vanvitelli" in Kampanien. Alle Patienten werden 12 Monate lang nach dem Ereignis überwacht, um eine klinische Bewertung (EKG, Belastungstest, Echokardiogramm, Glukosewerte) durchzuführen, wie in den Richtlinien für die Behandlung von STEMI-Patienten angegeben (6). Zu diesen Zeitpunkten werden auch Stuhlproben zur Analyse der Mikrobiota entnommen. Darüber hinaus wird der Arzt in das Management und die Bewertung des glykämischen Ausgleichs in den 12 Monaten der Nachsorge einbezogen, um HbA1c-Spiegel < 7 %, Glykämie zwischen 90 und 140 mg / dl und postprandiale Glykämie < 180 mg aufrechtzuerhalten /dl.

Kardiovaskuläre Endpunkte Die kardiovaskulären Endpunkte in beiden Kohorten umfassen erneuten Myokardinfarkt, Rehospitalisierung wegen koronarer Herzkrankheit (Re-Stenose, Stent-Implantation oder aorto-koronarer Bypass), Herzinsuffizienz, Schlaganfall, kardiale Mortalität und alle Todesursachen . Der primäre kombinierte Endpunkt besteht aus kardiovaskulären Ereignissen wie Myokardinfarkt, Krankenhauseinweisung wegen Herzinsuffizienz, Schlaganfall oder Herzsterblichkeit. Der sekundäre Endpunkt wird in der Beurteilung der Herzfunktion bestehen: Verringerung der Ejektionsfraktion, Volumenzunahme des linken Ventrikels, Verringerung der Koronardurchblutung. Alle Todesfälle werden überprüft und als kardial (Tod verursacht durch IMA, ventrikuläre Arrhythmien, refraktäre Herzinsuffizienz) oder nicht kardial eingestuft. Alle Revaskularisationen werden als früh (elektive Revaskularisation innerhalb von 60 Tagen nach Koronarangiographie) oder spät klassifiziert. Nur späte Revaskularisationen werden als kardiale Ereignisse klassifiziert, sodass Patienten mit früher elektiver Revaskularisation von der Analyse ausgeschlossen werden.

Statistische Analyse Die beiden Gruppen werden unter Verwendung des Pearson-χ2-Tests für kategoriale Variablen und des Kruskal-Wallis-Tests für kontinuierliche Variablen verglichen. Die kovariaten Kandidaten für den Eintritt in das multivariable Modell werden identifiziert, indem man sich auf die Faktoren konzentriert, die sich in der univariaten Analyse zwischen hyperglykämischen vs. normoglykämischen Patienten signifikant unterscheiden (P-Wert < 0,05). Die Cox-Regression wird verwendet, um das Sterblichkeitsmodell zu erstellen. Die Hazard Ratio für die Sterblichkeit wird für Alter, BMI, Cholesterin, LDL, Triglyceride und Aspirintherapie, Ticlopidin, Kombination von Anti-Aggregaten, β-Blockern, ACE-Hemmern oder Sartanen, Antidiabetika, Statinen während des Krankenhausaufenthalts wegen STEMI angepasst. Die Überlebensanalyse im ersten Jahr von STEMI wird unter Verwendung der Kaplan-Meier-Kurve und der Cox-Regressionsmethode durchgeführt. Die Sterblichkeitskurven werden separat für hyperglykämische Patienten vs. Normoglykämie erhalten, um unter Verwendung des Log-Rank-Tests verglichen zu werden. Alle Tests werden als signifikant angesehen, wenn der p-Wert < 0,05 ist. Alle Analysen werden in den beiden Studienpopulationen durchgeführt. Eine „Propensity Score“-Analyse wird unter Verwendung eines „nicht sparsamen“ logistischen Regressionsmodells durchgeführt, das die Ergebnisse der hyperglykämischen v/s-normoglykämischen Patienten vergleicht. Weitere Variablen werden in das Modell aufgenommen, darunter Alter, Geschlecht, Diabetes, Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, Mehrgefäßerkrankung, chronisches Nierenversagen, TIMI-Fluss vor dem Eingriff, Ejektionsfraktion und Verfahrenserfolg. Der C-Score zeigt eine gute Diskrimination an. Basierend auf den „abgeglichenen“ Proben wird das proportionale Risikomodell von Cox verwendet, um die Auswirkung von Hyperglykämie und der Aktivität der mikrobiotischen Flora auf die Sterblichkeit während der Nachsorge zu bestimmen. SPSS (Version 21, IBM SPSS) wird für alle Analysen verwendet.

Stichprobengröße Die Stichprobengröße wird mit einem IBM PC-Computer durch die GPOWER-Software berechnet. Der Größeneffekt wird gemäß den epidemiologischen und interventionellen Studien berechnet, die an hyperglykämischen Patienten durchgeführt wurden. Die geschätzte Stichprobengröße bei einem globalen Effekt von 25 % mit einem Typ-I-Fehler von 0,05 und einer Power von 95 % beträgt 200 Teilnehmer, 100 für die Gruppe der normoglykämischen Patienten und 100 für die Gruppe der hyperglykämischen Patienten.