Analisi del Microbiota e STEMI

L'iperglicemia è un reperto comune nei pazienti con diagnosi di sindrome coronarica acuta (ACS) ed è un predittore indipendente di mortalità nei pazienti con e senza diabete (1-4). Sebbene l'intervento coronarico percutaneo (PCI) sia la pietra angolare dell'infarto del miocardio con sopraslivellamento del segmento ST (STEMI) (4-6), l'incidenza di scompenso cardiaco, reinfarto e morte nei pazienti iperglicemici rimane significativa, con una mortalità superiore al 40%. % un anno dopo l'evento (4-5). Infatti, i fenomeni di restenosi e di no-reflow sono eventi comuni che portano a esiti clinici peggiori, nei pazienti iperglicemici sottoposti a PCI primario, e determinano embolizzazione aterotrombotica, aumento dello stress ossidativo e infiammazione (3-6). Nel tentativo di contrastare l'aumento della mortalità per iperglicemia, le unità coronariche hanno implementato protocolli insulinici per normalizzare la glicemia durante l'ACS, e lo stesso trattamento insulinico ha mostrato risultati contrastanti (7). I dati provenienti da piccoli studi pilota, da studi clinici moderati e da una meta-analisi hanno suggerito benefici dalla terapia insulinica (1-3,5). D'altra parte, successivi studi clinici randomizzati non hanno confermato un aumento della sopravvivenza (7, 8). Inoltre, se la duplice terapia antiaggregante è attualmente la base terapeutica dei pazienti con STEMI trattati con PCI (9), la sempre più frequente terapia antiaggregante ei fenomeni emorragici, possono ridurne l'efficacia terapeutica (11-13). Pertanto, è probabile che la risposta individuale alla duplice terapia antiaggregante e lo stress iperglicemico possano influenzare i meccanismi di resistenza e/o portare ad un aumento della disattivazione funzionale farmacologica da parte della flora microbica. Con il termine microbiota si indica la totalità dei genomi di microrganismi che risiedono in una nicchia ecologica, e che costituiscono il "microbiota umano" (14). In base al distretto anatomico analizzato si parla di microbiota intestinale, oculare, buccale, vaginale, ecc. L'analisi del DNA dei microrganismi che vivono nel tratto intestinale umano, realizzata con metodi metagenomici dal consorzio MetaHIT, ha identificato oltre 3 milioni di geni, 150 volte quelli della specie umana (16-21). Inoltre, le malattie cardiovascolari come l'ipertensione e la malattia coronarica sono fortemente condizionate dalla presenza di Enterobacteriaceae, Firmicutes e Lattobacilli nell'intestino, che possono determinarne l'insorgenza (22). In questo contesto, l'analisi del microbiota fecale prima della PCI, alla dimissione ospedaliera e al follow-up, potrebbe essere considerata utile per identificare pazienti iperglicemici con alterazione dei processi metabolico-ossidativi e correlati protrombotici con peggiore prognosi post procedurale ( 23 ). La facilità di ottenere campioni di microbiota fecale, e il relativo impatto sulla comunità scientifica e sulla pratica clinica di routine, ci spinge a insistere sulla ricerca clinica, insieme a un'analisi genomica, metabolica e cellulare del microbiota, e ad estrarre quanto più informazioni possibili nei pazienti iperglicemici con STEMI. Questa indagine non è mai stata proposta nella ricerca scientifica e nella pratica clinica dei pazienti iperglicemici ospedalizzati per STEMI. Infatti, una grande quantità di prove suggerisce che l'iperglicemia provoca una crescente produzione di stress ossidativo e infiammazione, sia nella placca aterosclerotica che nel trombo, e quindi svolge un ruolo centrale nel determinare esiti peggiori nello STEMI. Pertanto, l'analisi del microbiota fecale durante l'evento potrebbe teoricamente identificare pazienti iperglicemici con eccessivo tono infiammatorio e ossidativo causato da iperglicemia, resistenza condizionante alla doppia terapia antiaggregante e stenting coronarico e condizionante fenomeni protrombotici dopo riperfusione coronarica da PCI. Pertanto, gli autori condurranno uno studio per analizzare il microbiota in pazienti con sindrome coronarica acuta iperglicemica e normoglicemica.

OBIETTIVI L'obiettivo primario di questo studio sarà valutare eventuali cambiamenti nel microbiota e la sua attività su materiale fecale prelevato prima del PCI, e dopo 6 e 12 mesi in pazienti con STEMI iperglicemico, e anche valutare se i cambiamenti nel microbiota possono essere correlati alla prognosi di 12 mesi.

MATERIALI E METODI Pazienti Questo è uno studio di coorte per indagare gli effetti di possibili cambiamenti nel microbiota e la sua attività in campioni fecali prelevati da pazienti con STEMI iperglicemico v/s normoglicemico. Questi pazienti vengono trattati secondo le pratiche terapeutiche di routine della "vita reale", adottate presso la Divisione di Cardiologia dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli". Dopo la dimissione dall'ospedale, tutti i pazienti saranno invitati ad effettuare le visite di controllo, come indicato dalle linee guida per la gestione dei pazienti post-STEMI (6), presso la Divisione di Cardiologia dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli" e presso la VI Divisione di Medicina Interna dell'Università degli Studi della Campania “Luigi Vanvitelli”. Tutti i pazienti saranno monitorati per 12 mesi dopo l'evento, come follow-up. Secondo la recente definizione dell'American Heart Association, l'iperglicemia sarà definita da livelli glicemici nel sangue a digiuno > 140 mg/dl (1, 9). Tutti i pazienti con insorgenza dei sintomi entro 12 ore e sopraslivellamento del tratto ST di 1 mm in 2 o più derivazioni periferiche contigue o almeno 2 mm in 2 o più derivazioni precordiali contigue o blocco di branca sinistra di nuova insorgenza saranno presi in considerazione per PCI. I criteri di inclusione includeranno: età superiore a 18 anni e ammissione al primo episodio di STEMI. Saranno esclusi i pazienti con frazione di eiezione ventricolare sinistra <25%, con pregresso IMA o pregresso PCI e/o by-pass. Ognuno sarà incluso nello studio dopo aver firmato un consenso informato. Le analisi ematologiche di routine verranno eseguite al momento dell'accettazione, prima di praticare la terapia medica ed eventuale visita coronarica e dopo 6 e 12 mesi. Su un'aliquota del campione di sangue prelevato in questi momenti, valuteremo la trimetilammina-N-ossido (TMAO), un prodotto del metabolismo batterico, i cui elevati livelli sierici sono associati ad eventi avversi cardiovascolari (24). Inoltre, prima del PCI, e 6 e 12 mesi dopo, verrà prelevato un campione di feci su cui verrà successivamente analizzato il microbiota. La ricerca sarà condotta in conformità con i principi della dichiarazione di Helsinki.

Procedura In questo studio gli autori valuteranno una coorte di pazienti con STEMI ricoverati presso la Divisione di Cardiologia dell'Università della Campania “Luigi Vanvitelli” e trattati con doppia terapia antiaggregante. Tutti i pazienti saranno trattati secondo i protocolli suggeriti dalle ultime Linee Guida sullo STEMI (6). I pazienti saranno classificati in due gruppi: pazienti iperglicemici v/s normoglicemici, in entrambi i gruppi di pazienti verrà effettuata l'analisi del microbiota fecale, pre PCI e pre doppia terapia antipiastrinica. Il microbiota verrà estratto dal materiale fecale, quindi preparato e successivamente analizzato. Non è possibile nella pratica clinica coltivare in laboratorio la stragrande maggioranza dei batteri intestinali, a fronte dell'enorme quantità di microrganismi presenti. Grazie alle più moderne tecniche di sequenziamento del DNA batterico (Next Generation Sequencing) estratto dal materiale fecale, è oggi possibile un'identificazione completa e affidabile del microbiota intestinale. Oltre ad identificare le specie batteriche presenti, gli autori sono anche in grado di esprimere un grado di salute complessivo del microbiota (o disbiosi), la sua efficienza nella produzione di alcune sostanze utili o nocive, l'adeguatezza del microbiota rispetto ad alcune funzioni fondamentali a cui è deputato e la propensione del microbiota stesso nei confronti delle malattie infiammatorie intestinali, delle malattie metaboliche e dell'invecchiamento. Il risultato è una mole impressionante di dati, una vera e propria carta d'identità del microbiota, denominata Microbiota passport.

Preparazione e analisi del campione. I campioni per il sequenziamento del microbiota saranno raccolti da materiale fecale e conservati a temperature estremamente basse (-80°C) per evitare danni al campione originale. Il sequenziamento del microbiota sarà eseguito dal laboratorio di Microbiologia dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli". Per il sequenziamento del microbiota utilizzeremo il metodo "NextGeneration Sequencing" (NGS), che consente il sequenziamento in parallelo di milioni di frammenti di DNA (25) attraverso l'utilizzo di macchinari Illumina (San Diego, CA). Il DNA sarà estratto da questi campioni utilizzando una procedura commerciale ad alta riproducibilità (Qiagen, Invitrogen). La resa finale e la qualità del DNA estratto saranno determinate utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA) e QubitFluorometer 1.0 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA). Il DNA estratto sarà amplificato mediante PCR con i primer: forward: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3' e reverse: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (Klindworth et al.2013), che mirano alla regione ipervariabile V3 e V4 del 16S gene dell'rRNA. Ogni amplificazione PCR sarà eseguita secondo il protocollo per la preparazione di librerie 16S per il sequenziamento metagenomico (Illumina, San Diego, CA). I prodotti dell'amplificazione saranno quantificati mediante il fluoridatore Qubit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) e raggruppati ad una quantità equimolare di ciascun campione con una concentrazione finale di 2nM. Ai campioni verrà aggiunta una libreria di controllo Phix (Illumina). I campioni raggruppati verranno quindi sequenziati sulla piattaforma MiSeq (Illumina, San Diego, CA). I dati così ottenuti saranno sottoposti a controlli di qualità mediante analisi bioinformatica con FastQC. Infine, i dati saranno analizzati secondo i test statistici suggeriti dalle linee guida per il sequenziamento metagenomico. I dati dei pazienti verranno confrontati tra loro e nel tempo con database di riferimento. La valutazione dell'attività epigenetica del microbiota e dei dosaggi biochimici di citochine e radicali liberi sarà effettuata presso il laboratorio di Farmacologia dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli. In particolare, per la valutazione dell'attività epigenetica del microbiota di ogni singolo paziente iperglicemico v/s normoglicemico con STEMI, si procederà secondo il protocollo QIAGEN (Italia) con l'estrazione da materiale fecale dell'RNA totale, compreso il basso -peso molecolare uno (microRNA). La resa finale e la qualità dell'RNA estratto saranno determinate utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop ND-1000 (ThermoScientific, Waltham, MA). Attraverso qRT-PCR (QIAGEN, Italia) verranno rilevati i livelli di espressione dei seguenti microRNA fecali: miR-10b, miR-204, miR-29, miR-496, miR-1224-5p, miR-470 e miR-663 coinvolto nella regolazione del microbiota intestinale; miR-10a e miR-18b coinvolti nella regolazione del microbiota intestinale e dell'infiammazione metabolica; miR-106a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-206, miR-222 e miR-223 coinvolti nell'infiammazione metabolica e nella segnalazione di insulina/IGF-1 (26). L'attività metabolica del microbiota in ogni singolo paziente iperglicemico v/s normoglicemico con STEMI sarà valutata mediante determinazione degli acidi grassi a catena corta (SCFA) da campioni fecali: i livelli di SCFA fecale, un prodotto della fermentazione batterica, sembrano correlare con un miglioramento nel diabete di tipo 2 (27). L'attività infiammatoria del microbiota sarà valutata determinando i livelli fecali di LPS (28-29), IL-1β e IL-6 (30-32), mentre l'attività ossidativa attraverso l'analisi dei livelli fecali di ROS, SOD e GSH (33-34).

Follow-up Lo studio degli autori è progettato per gestire i pazienti iperglicemici v/s normoglicemici con STEMI nella "vita reale", senza interferenze da parte delle rigide regole che limitano la generalizzabilità degli RCT. Pertanto, dopo la dimissione dall'ospedale, tutti i pazienti saranno invitati ad effettuare le visite di controllo, come indicato dalle linee guida per la gestione dei pazienti post-STEMI (6), presso la Divisione di Cardiologia dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli" , e presso la VI Divisione di Medicina Interna dell'Università della Campania “Luigi Vanvitelli”. Tutti i pazienti saranno monitorati per 12 mesi dopo l'evento, come follow-up, per praticare la valutazione clinica (ECG, test da sforzo, ecocardiogramma, livelli di glucosio), come indicato dalle linee guida per la gestione dei pazienti con STEMI (6). In questi momenti verranno prelevati anche campioni di feci per l'analisi del microbiota. Inoltre, nella gestione e valutazione del compenso glicemico nei 12 mesi di follow-up, sarà coinvolto anche il medico al fine di mantenere livelli di HbA1c <7%, glicemia tra 90 e 140 mg/dl e glicemia postprandiale <180 mg / dl.

Endpoint cardiovascolari Gli endpoint cardiovascolari in entrambe le coorti includeranno reinfarto miocardico, riospedalizzazione per malattia coronarica (restenosi, impianto di stent o bypass aorto-coronarico), insufficienza cardiaca, ictus, mortalità cardiaca e tutte le cause di mortalità . L'endpoint composito primario consisterà in eventi cardiovascolari, come infarto miocardico, ricovero per insufficienza cardiaca, ictus o mortalità cardiaca. L'endpoint secondario consisterà nella valutazione della funzione cardiaca: riduzione della frazione di eiezione, aumento del volume del ventricolo sinistro, riduzione della perfusione coronarica. Tutti i decessi saranno esaminati e classificati come cardiaci (morte causata da IMA, aritmie ventricolari, insufficienza cardiaca refrattaria) o non cardiaci. Tutte le rivascolarizzazioni saranno classificate come precoci (rivascolarizzazione elettiva entro 60 giorni dall'angiografia coronarica) o tardive. Solo le rivascolarizzazioni tardive saranno classificate come eventi cardiaci, quindi i pazienti con rivascolarizzazione elettiva precoce saranno esclusi dall'analisi.

Analisi statistica I due gruppi saranno confrontati utilizzando il test di Pearson χ2 per le variabili categoriali e il test di Kruskal-Wallis per le variabili continue. Le covariate candidate per l'ingresso nel modello multivariabile saranno identificate concentrandosi sui fattori che differiranno significativamente (valore P <0,05) nell'analisi univariata tra pazienti iperglicemici v/s normoglicemici. La regressione di Cox verrà utilizzata per costruire il modello di mortalità. L'Hazard Ratio per la mortalità sarà aggiustato per età, BMI, colesterolo, LDL, trigliceridi e terapia con aspirina, ticlopidina, combinazione di antiaggreganti, β-bloccanti, ACE inibitori o sartani, antidiabetici, statine, durante il ricovero per STEMI. L'analisi della sopravvivenza durante il primo anno dallo STEMI sarà eseguita utilizzando la curva di Kaplan-Meier e il metodo di regressione di Cox. Le curve di mortalità saranno ottenute separatamente per pazienti iperglicemici vs/s normoglicemia, da confrontare utilizzando il log-rank test. Tutti i test saranno considerati significativi se p value <0.05. Tutte le analisi saranno effettuate nelle due popolazioni in studio. Verrà eseguita un'analisi del "propensity score" utilizzando un modello di regressione logistica "non parsimonioso" che confronterà gli esiti dei pazienti iperglicemici rispetto a quelli normoglicemici. Nel modello saranno incluse più variabili tra cui età, sesso, diabete, ipertensione, ipercolesterolemia, malattia multivasale, insufficienza renale cronica, flusso pre-procedura TIMI, frazione di eiezione e successo procedurale. Il punteggio C indicherà una buona discriminazione. Sulla base dei campioni "accoppiati", il modello di rischio proporzionale di Cox sarà utilizzato per determinare l'impatto dell'iperglicemia e dell'attività della flora microbica sulla mortalità durante il follow-up. SPSS (versione 21, IBM SPSS) verrà utilizzato per tutte le analisi.

Dimensione del campione La dimensione del campione sarà calcolata con computer IBM PC dal software GPOWER. L'effetto dimensionale sarà calcolato in base agli studi epidemiologici e interventistici eseguiti su pazienti iperglicemici. La dimensione del campione stimata su un effetto globale del 25% con errore di tipo I di 0,05 e una potenza del 95% sarà di 200 partecipanti, 100 per il gruppo composto da pazienti normoglicemici e 100 per il gruppo di pazienti iperglicemici.