간세포 암종의 진단 및 예후 바이오마커로서의 MiRNA

배경:

간세포 암종(HCC)은 세계에서 6번째로 흔한 암이며 암 사망률은 3번째입니다(Kamangar et al., 2006). 간세포 암종의 치료에는 외과적 절제, RFA(radiofrequency ablation) 및 PEI(percutaneous ethanol injection)와 같은 국소 요법, 경동맥 화학색전술(TACE) 및 최선의 지지 요법(Bruix and Sherman, 2005)이 포함됩니다. 외과적 개입이나 국소 요법의 대상자가 아닌 환자의 경우 소라페닙이 권장됩니다(Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). 그러나 외과적 절제와 같은 성공적인 치료 후에도 대부분의 환자는 종양의 재발 또는 진행을 보였다(Bruix and Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Okuda staging system, AJCC system, BCLC staging system, CLIP score system 등 간세포암종의 여러 병기체계가 개발되었으나 각 병기체계의 예후적 가치는 일정하지 않다(Chen et al., 2009). 각 병기결정 시스템의 적용 가능성은 선택한 치료 방법론에 따라 다릅니다.

간세포암종의 결과를 예측하는 임상 병기결정 시스템의 단점 때문에 간세포암종의 예후를 예측하기 위해 혈청 바이오마커를 검색하는 것은 큰 관심거리입니다(Fujiyama et al., 2002; Marrero and Lok, 2004). 그 중 알파-태아단백(AFP)이 가장 많이 연구되었습니다. AFP는 간세포암 진단의 표지자(Bruix et al., 2001)와 새로 진단된 간세포암종(1998)의 예후 인자로 사용되어 왔다. AFP는 또한 화학요법 반응에 대한 예측 인자로서 가치가 있습니다(Chan et al., 2009). 그러나 종양의 수술적 절제 후 또는 국소 치료 후 간세포암종에 대한 AFP의 적용 가능성은 아직 불확실하다. 간세포암종과 AFP의 정상 혈청 수준을 가진 환자의 경우 APF는 예후 인자로 사용할 수 없습니다. 글리페칸-3과 같은 다른 바이오마커는 아직 개발 중입니다(Marrero and Lok, 2004).

17~25개의 뉴클레오티드 비암호화 RNA인 MicroRNA(miRNA)는 암에서 자주 조절되지 않으며 암 선별, 진단, 치료 효능 모니터링 및 예후 예측을 위한 새로운 비침습적 바이오마커로 부상하고 있습니다(Wu et al., 2007). MiRNA는 내인성 RNase에 대한 저항성으로 혈청에서 안정적으로 발현되며 높은 안정성으로 쉽게 보관됩니다(Aref et al., 2014). 여러 연구에서 간암, 결장직장암 및 췌장암과 같은 많은 암에서 인간 혈청 miRNA의 비정상적인 발현이 나타났습니다(Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). HCC의 진단 바이오마커로서 miRNA의 민감도는 최대 80%일 수 있습니다(Yin et al., 2014). miRNA 어레이를 사용하면 miRNA 시그니처를 생성하고 종양 진단 및 예후 예측을 위한 바이오마커의 민감도와 특이성을 더욱 향상시킬 수 있습니다.

시험 목적：

1. HCC에 대한 진단 또는 예측 바이오마커로서 혈청 miRNA를 식별합니다.
2. 혈청, HCC 종양 조직 및 인접 비종양 조직 사이의 miRNA 발현 수준과 상관관계를 확인합니다.
3. HCC의 치료에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있는 유전자/유전적 변이에 대한 향후 탐색적 연구를 위해 디옥시리보핵산(DNA)을 수집하고 저장합니다.
4. HCC의 치료에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있는 단백질/유전자/유전적 변이에 대한 향후 탐색적 연구를 위해 잉여 혈장 및 종양 조직을 수집하고 저장합니다.

방법： 연구 설계 이것은 전향적 연구입니다. 모든 환자는 정보에 입각한 동의를 제공해야 합니다. National Taiwan University 및 Far-Eastern Memorial Hospital에서 HCC 진단을 받은 20세 이상의 총 200명의 환자가 등록됩니다. HCC의 진단 기준은 2011 AASLD 기준(Bruix et al., 2011)에 따른다. 요컨대, 간경변증 간 초음파 검사에서 발견된 1cm 이상의 결절은 CT 스캔 또는 조영 MRI 중 하나의 동적 연구로 추가 조사해야 합니다. 한 가지 기술에서 외관이 HCC의 전형적인 경우(즉, 문맥기/정맥기에 씻김이 있는 과혈관성)이면 병변은 HCC로 진단됩니다. 소견이 특징적이지 않거나 혈관 프로필이 기법 간에 일치하지 않는 경우 병변을 생검해야 합니다. 임상 병기의 경우 BCLC 병기 및 임상 TNM 시스템을 포함하여 두 가지 병기 시스템이 이러한 환자에게 적용될 것입니다. 임상병리학적 데이터는 전향적으로 수집될 것이다. 치료 독성, 수정된 RECIST 기준에 의해 정의된 치료 반응, 질병 진행 및 전체 생존을 포함한 임상 결과가 기록됩니다.

검체 및 혈청 수집 혈액 샘플은 치료 전, 치료 7일 후 및 치료 1개월 후의 3가지 시점에서 수집됩니다. 혈액 샘플은 수집 시 혈장 및 단핵 세포로 분리되며 추가 사용 전에 -20º에 보관됩니다. 치료 방법으로는 수술, TACE, RFA, PEI 또는 소라페닙 사용을 포함한 항혈관형성제 등이 있다.

조직 수집 HCC 조직(T) 및 해당 비종양 간 조직(NT)을 확보합니다. 수술 표본은 수술 직후 동결되어 -140°C에 보관됩니다.

바이러스 마커 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 및 HCV에 대한 항체(항-HCV)는 모든 환자에 대해 상업적으로 이용 가능한 효소 결합 면역흡착 분석 키트를 사용하여 확인됩니다. HBsAg 양성 환자의 경우, HBeAg 및 항-HBe는 효소 결합 면역흡착 분석으로 측정됩니다. HBV DNA의 혈청 수준은 자체 TaqMan 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 측정됩니다. 항 HCV 양성 환자의 경우 사내 TaqMan 실시간 PCR로 HCV RNA를 측정합니다.

RNA 분리, 역전사 및 miRNA 어레이 혈장 분리를 위해 혈액 샘플을 EDTA 함유 튜브로 끌어들여 4,000x g에서 15분 동안 원심분리합니다. 혈장을 깨끗한 마이크로원심분리기 튜브에 옮기고 다시 12,000x g에서 5분 동안 원심분리한 후 혈장 200 ul를 새로운 마이크로원심분리기 튜브로 옮기고 분석 전까지 -80_C에 보관합니다. RNA는 제조업체의 지침에 따라 High Pure miRNA Isolation Kit(Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 분리한 다음 실험 전까지 -80_C에서 보관합니다.

역전사 반응 qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)에 의한 miRNA 분석을 위해 TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 총 RNA 100ng을 역전사합니다. 모든 반응은 제조업체 프로토콜에 지정된 대로 수행됩니다.

TaqMan 저밀도 어레이 TLDA를 분석하여 3가지 샘플 세트(전처리, 처리 7일 후, 처리 1개월 후) 사이에서 차별적으로 발현된 miRNA의 프로파일을 식별합니다. 요약하면 총 RNA는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트 및 Megaplex RT 세트 풀 A 및 B 버전 3.0(Applied Biosystems)에 의해 cDNA로 역전사됩니다. RT 제품은 TaqMan Array Human MicroRNA A+B 카드 세트 v3.0(Applied Biosystems)에 로드되어 667개의 인간 miRNA를 동시에 정량화할 수 있습니다. TaqMan microRNA 어세이 및 분석은 ABI 7900HT 기기(Applied Biosystems)에서 수행됩니다. 모든 반응은 표준 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. ABI 7900HT SDS 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 정량적 miRNA 발현 데이터를 획득하고 정규화했습니다.

정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) TaqMan 저밀도 어레이를 통해 검출된 miRNA의 발현은 또한 이전에 기술된 바와 같이 qRT-PCR 분석에 의해 HCC 종양 및/또는 쌍을 이룬 정상 간 조직에서도 연구될 것입니다(Lee et al. ., 2011). RNU6B snRNA는 내인성 대조군으로 사용되었습니다. 각 microRNA 분석은 3중으로 수행되었습니다. 마이크로RNA의 발현은 델타 Ct 값(RNU6B의 Ct 값 - 표적 마이크로RNA의 Ct 값)으로 보고되었다. 연구자들은 각 microRNA의 중간 발현 값을 기준으로 발현이 높거나 낮은 종양 또는 세포 그룹을 정의했습니다.

통계 분석 전체 생존 및 무진행 생존은 Kaplan-Meier의 방법을 사용하여 평가됩니다. proteomic 연구를 통해 특정 단백질이 확인되면 환자는 모든 환자의 miRNA 혈장 중 발현 수준 중앙값에 따라 고발현군과 저발현군으로 나뉩니다. 고 발현 그룹과 저 발현 그룹 간의 생존 차이는 로그 순위 테스트를 사용하여 분석됩니다. 0.05 미만의 p-값은 유의한 것으로 간주됩니다.