MiARN como biomarcador diagnóstico y pronóstico del carcinoma hepatocelular

Fondo:

El carcinoma hepatocelular (HCC) es el sexto cáncer más común y la tercera tasa de mortalidad por cáncer en el mundo (Kamangar et al., 2006). Los tratamientos del carcinoma hepatocelular incluyen la resección quirúrgica, terapias locales como la ablación por radiofrecuencia (RFA) y la inyección percutánea de etanol (PEI), la quimioembolización transarterial (TACE) y la mejor atención de apoyo (Bruix y Sherman, 2005). Para pacientes que no son candidatos a intervención quirúrgica o terapias locales, se recomienda sorafenib (Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). Sin embargo, incluso después de un tratamiento exitoso como la resección quirúrgica, la mayoría de los pacientes sufrieron recurrencia o progresión del tumor (Bruix y Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Aunque se han desarrollado varios sistemas de estadificación del CHC, como el sistema de estadificación de Okuda, el sistema AJCC, el sistema de estadificación BCLC y el sistema de puntuación CLIP, el valor pronóstico de cada sistema de estadificación no es consistente (Chen et al., 2009). y la aplicabilidad de cada sistema de estadificación depende de la metodología de tratamiento seleccionada.

Debido a la deficiencia de los sistemas de estadificación clínica para predecir el resultado del CHC, es de gran interés buscar biomarcadores séricos para predecir el pronóstico del CHC (Fujiyama et al., 2002; Marrero y Lok, 2004). Entre ellos, la alfa-fetoproteína (AFP) es la más estudiada. La AFP se ha utilizado como marcador en el diagnóstico de CHC (Bruix et al., 2001) y como factor de pronóstico para CHC recién diagnosticado (1998). La AFP también tiene valor como factor predictivo de la respuesta a la quimioterapia (Chan et al., 2009). Sin embargo, la aplicabilidad de la AFP para el CHC después de la resección quirúrgica del tumor o después de la terapia local aún es incierta. Para los pacientes con CHC y niveles séricos normales de AFP, la APF no podría usarse como factor pronóstico. Otros biomarcadores, como el glipecan-3, aún están en desarrollo (Marrero y Lok, 2004).

Los microARN (miARN), ARN no codificantes de 17 a 25 nucleótidos, están frecuentemente desregulados en el cáncer y emergen como nuevos biomarcadores no invasivos para la detección y el diagnóstico del cáncer, monitorear la eficacia de la terapia y predecir el pronóstico (Wu et al., 2007). Los miARN se expresan de manera estable en el suero debido a su resistencia a la ARNasa endógena y se almacenan fácilmente con alta estabilidad (Aref et al., 2014). Varios estudios han demostrado una expresión anormal de miARN en suero humano en muchos tipos de cáncer, como el cáncer de hígado, colorrectal y pancreático (Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). La sensibilidad de miRNA como biomarcador de diagnóstico de HCC podría ser de hasta un 80 % (Yin et al., 2014). El uso de matrices de miARN puede generar firmas de miARN y mejorar aún más la sensibilidad y la especificidad de los biomarcadores para el diagnóstico de tumores y la predicción del pronóstico.

Propósito de prueba:

1. Identificar miARN sérico como biomarcador de diagnóstico o predicción de CHC.
2. Para correlacionar con el nivel de expresión de miARN entre suero, tejido tumoral de HCC y tejido no tumoral adyacente.
3. Recolectar y almacenar ácido desoxirribonucleico (ADN) para futuras investigaciones exploratorias sobre genes/variaciones genéticas que pueden influir en la respuesta al tratamiento en CHC.
4. Para recolectar y almacenar excedentes de plasma y tejidos tumorales para futuras investigaciones exploratorias sobre proteínas/genes/variaciones genéticas que pueden influir en la respuesta al tratamiento en CHC.

Métodos： Diseño del estudio Este es un estudio prospectivo. Todos los pacientes deben proporcionar consentimientos informados. Se inscribirá un total de 200 pacientes mayores de 20 años a quienes se les haya diagnosticado CHC en la Universidad Nacional de Taiwán y en el Far-Eastern Memorial Hospital. Los criterios de diagnóstico de HCC están de acuerdo con los criterios AASLD de 2011 (Bruix et al., 2011). En resumen, los nódulos de más de 1 cm que se encuentran en la ecografía de un hígado cirrótico deben investigarse más a fondo con un estudio dinámico, ya sea una tomografía computarizada o una resonancia magnética con contraste. Si la apariencia es típica de CHC (es decir, hipervascular con lavado en la fase portal/venosa) en una técnica, la lesión se diagnosticaría como CHC. Si los hallazgos no son característicos o el perfil vascular no coincide entre técnicas, se debe biopsiar la lesión. Para la estadificación clínica, se aplicarán dos sistemas de estadificación a estos pacientes, incluida la estadificación BCLC y el sistema TNM clínico. Los datos clinicopatológicos se recogerán de forma prospectiva. Se registrarán los resultados clínicos, incluida la toxicidad del tratamiento, la respuesta al tratamiento según lo definido por los criterios RECIST revisados, la progresión de la enfermedad y la supervivencia general.

Recolección de muestras y suero Las muestras de sangre se recolectarán en 3 puntos de tiempo: antes del tratamiento, 7 días después del tratamiento y un mes después del tratamiento. Las muestras de sangre se separarán en plasma y células mononucleares en el momento de la recolección y se almacenarán a -20 ºC antes de su uso posterior. Los métodos de tratamiento incluyen operación, TACE, RFA, PEI o agente antiangiogénico, incluido el uso de sorafenib.

Recogida de tejidos Se obtendrán los tejidos HCC (T) y los correspondientes tejidos hepáticos no tumorales (NT). Las muestras quirúrgicas se congelarán inmediatamente después de la cirugía y se almacenarán a -140 °C.

El marcador viral del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo contra el VHC (anti-VHC) se comprobarán utilizando kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas disponibles en el mercado para cada paciente. Para pacientes con HBsAg positivo, HBeAg y anti-HBe se medirán mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. El nivel sérico de ADN del VHB se medirá mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real TaqMan interna. Para los pacientes anti-VHC positivos, el ARN del VHC se medirá mediante una PCR en tiempo real TaqMan interna.

Aislamiento de ARN, transcripción inversa y matriz de miARN Muestras de sangre extraídas en tubos que contienen EDTA y centrifugadas a 4000x g durante 15 minutos para la separación del plasma. El plasma se transfirió a un tubo de microcentrífuga limpio y se volvió a centrifugar a 12 000 x g durante 5 min. Se transferirán 200 ul de plasma a un nuevo tubo de microcentrífuga y se almacenarán a -80 _C hasta el análisis. El ARN se aislará utilizando el kit de aislamiento de miARN High Pure (Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y luego se almacenará a -80 _C hasta el experimento.

Reacción de transcripción inversa Para los análisis de miARN mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), 100 ng de ARN total se transcribirán de forma inversa utilizando el kit de transcripción inversa de miARN TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE. UU.). Todas las reacciones se realizarán según lo especificado en el protocolo del fabricante.

Las matrices de baja densidad TaqMan TLDA se analizarán para identificar el perfil de los miARN expresados ​​diferencialmente entre los tres conjuntos de muestras (pretratamiento, 7 días después del tratamiento, un mes después del tratamiento). En resumen, el ARN total se transcribirá inversamente en ADNc mediante el kit de transcripción inversa TaqMan MicroRNA y Megaplex RT set pool A y B versión 3.0 (Applied Biosystems). El producto RT se cargará en el juego de tarjetas TaqMan Array Human MicroRNA A+B v3.0 (Applied Biosystems), lo que permitirá la cuantificación simultánea de 667 miRNA humanos. Los ensayos y análisis de microARN TaqMan se realizarán en el instrumento ABI 7900HT (Applied Biosystems). Todas las reacciones se realizaron de acuerdo con los protocolos estándar de los fabricantes. Los datos cuantitativos de expresión de miARN se adquirieron y normalizaron utilizando el software ABI 7900HT SDS (Applied Biosystems).

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) La expresión de miARN detectada a través de matrices de baja densidad TaqMan también se estudiará en los tumores HCC y/o su tejido hepático normal emparejado mediante análisis qRT-PCR como se describió anteriormente (Lee et al. ., 2011). RNU6B snRNA se utilizó como control endógeno. Cada ensayo de microARN se realizó por triplicado. La expresión de los microARN se informó como valor delta Ct (valor Ct de RNU6B - valor Ct del microARN diana). Los investigadores definieron los grupos de tumores o células con alta o baja expresión en función del valor medio de expresión de cada microARN.

Análisis estadístico La supervivencia global y la supervivencia libre de progresión se evaluarán mediante el método de Kaplan-Meier. Una vez que se identifica una proteína específica mediante el estudio proteómico, los pacientes se dividirán en un grupo de alta expresión y un grupo de baja expresión, de acuerdo con el nivel medio de expresión plasmática del miARN de todos los pacientes; La diferencia de supervivencia entre el grupo de alta expresión y el grupo de baja expresión se analizará mediante la prueba de rango logarítmico. Se considerará significativo un valor de p inferior a 0,05.