MiRNA som en diagnostisk og prognostisk biomarkør for hepatocellulært karsinom

Bakgrunn:

Hepatocellulært karsinom (HCC) er den sjette vanligste kreftformen og den tredje dødeligheten av kreft i verden (Kamangar et al., 2006). Behandlinger av hepatocellulært karsinom inkluderer kirurgisk reseksjon, lokale terapier som radiofrekvensablasjon (RFA) og perkutan etanolinjeksjon (PEI), transarteriell kjemoembolisering (TACE) og beste støttebehandling (Bruix og Sherman, 2005). For pasienter som ikke er kandidater for kirurgisk inngrep eller lokale terapier, anbefales sorafenib (Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). Men selv etter vellykket behandling som kirurgisk reseksjon, led de fleste pasienter av tilbakefall eller progresjon av svulsten (Bruix og Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Selv om det er utviklet flere iscenesettelsessystemer av HCC, for eksempel Okuda iscenesettelsessystem, AJCC-system, BCLC iscenesettelsessystem og CLIP-scoresystem, er den prognostiske verdien til hvert iscenesettelsessystem ikke konsistent (Chen et al., 2009), og anvendeligheten til hvert iscenesettelsessystem avhenger av den valgte behandlingsmetodikken.

På grunn av mangelen på kliniske stadiesystemer i å forutsi utfallet av HCC, er det av stor interesse å søke etter biomarkører i serum for å forutsi prognosen for HCC (Fujiyama et al., 2002; Marrero og Lok, 2004). Blant dem er alfa-fetoprotein (AFP) det mest godt studerte. AFP har blitt brukt som en markør ved diagnostisering av HCC (Bruix et al., 2001) og som en prognostisk faktor for nydiagnostisert HCC(1998). AFP er også av verdi som en prediktiv faktor for kjemoterapirespons (Chan et al., 2009). Anvendeligheten av AFP for HCC etter kirurgisk reseksjon av tumor eller etter lokal terapi er imidlertid fortsatt usikker. For pasienter med HCC og normalt serumnivå av AFP kunne APF ikke brukes som en prognostisk faktor. Andre biomarkører, som glipecan-3, er fortsatt under utvikling (Marrero og Lok, 2004).

MikroRNA (miRNA), 17- til 25-nukleotider ikke-kodende RNA-er, er ofte dysregulert i kreft og fremstår som en ny ikke-invasiv biomarkør for kreftscreening, diagnose, overvåking av terapieffektivitet og forutsig prognose (Wu et al., 2007). MiRNA er stabilt uttrykk i serum som deres motstand mot endogen RNase og lett lagring med høy stabilitet (Aref et al., 2014). Flere studier har vist unormalt uttrykk av humant serum miRNA i mange kreftformer som lever-, kolorektal- og bukspyttkjertelkreft (Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). Sensitiviteten til miRNA som en diagnostisk biomarkør for HCC kan være opptil 80 % (Yin et al., 2014). Bruk av miRNA-matriser kan generere miRNA-signaturer og ytterligere forbedre sensitiviteten og spesifisiteten til biomarkøren for tumordiagnose og prognoseprediksjon.

Prøveformål:

1. For å identifisere serum miRNA som en diagnose eller prediksjonsbiomarkør for HCC.
2. For å korrelere med ekspresjonsnivået til miRNA mellom serum, HCC tumorvev og tilstøtende ikke-tumorvev.
3. Å samle inn og lagre deoksyribonukleinsyre (DNA) for fremtidig utforskende forskning på gener/genetisk variasjon som kan påvirke respons på behandling i HCC.
4. Å samle og lagre overskuddsplasma og tumorvev for fremtidig utforskende forskning på proteiner/gener/genetisk variasjon som kan påvirke respons på behandling i HCC.

Metoder: Studiedesign Dette er en prospektiv studie. Alle pasienter må gi informert samtykke. Totalt 200 pasienter i alderen >20 år som får diagnosen HCC ved National Taiwan University og Far-Eastern Memorial Hospital vil bli registrert. De diagnostiske kriteriene for HCC er i henhold til 2011 AASLD-kriterier (Bruix et al., 2011). Kort sagt, knuter over 1 cm funnet ved ultralydscreening av en skrumplever bør undersøkes videre med én dynamiske studier, enten CT-skanning eller kontrast-MR. Hvis utseendet er typisk for HCC (dvs. hypervaskulært med utvasking i portal/venøs fase) i en teknikk, vil lesjonen bli diagnostisert som HCC. Hvis funnene ikke er karakteristiske eller den vaskulære profilen ikke er tilfeldig blant teknikkene, bør lesjonen biopsieres. For klinisk iscenesettelse vil to iscenesettelsessystemer bli brukt på disse pasientene, inkludert BCLC iscenesettelse og klinisk TNM-system. Klinisk patologiske data vil bli samlet inn prospektivt. Kliniske utfall, inkludert behandlingstoksisitet, behandlingsrespons som definert av de reviderte RECIST-kriteriene, sykdomsprogresjon og total overlevelse vil bli registrert.

Prøve- og seruminnsamling Blodprøver vil bli tatt på 3 tidspunkter før behandling, 7 dager etter behandling og én måned etter behandling. Blodprøver vil bli separert i plasma og mononukleære celler ved innsamling og vil bli lagret i -20Ç før videre bruk. Behandlingsmetodene inkluderer operasjon, TACE, RFA, PEI eller anti-angiogenesemiddel inkludert sorafenibbruk.

Vevssamling HCC-vevet (T) og det tilsvarende ikke-tumor-levervevet (NT) vil bli oppnådd. De kirurgiske prøvene vil fryses umiddelbart etter operasjonen og lagres i -140°C.

Viral markør Hepatitt B-overflateantigen (HBsAg) og antistoff mot HCV (anti-HCV) vil bli kontrollert ved å bruke kommersielt tilgjengelige enzymkoblede immunsorbentanalysesett for hver pasient. For HBsAg-positive pasienter vil HBeAg og anti-HBe bli målt ved hjelp av enzymkoblet immunosorbantanalyse. Serumnivået av HBV-DNA vil bli målt med egen TaqMan-sanntidspolymerasekjedereaksjon (PCR). For anti-HCV-positive pasienter vil HCV-RNA bli målt ved hjelp av egen TaqMan sanntids PCR

RNA-isolering, revers transkripsjon og miRNA-array Blodprøver trukket inn i EDTA-holdige rør og sentrifugert ved 4000x g i 15 minutter for plasmaseparasjon. Plasma overført til et rent mikrosentrifugerør og sentrifugert igjen ved 12 000 x g i 5 minutter og 200 ul plasma vil bli overført til et nytt mikrosentrifugerør og lagret ved -80 _C frem til analyse. RNA vil isoleres ved hjelp av High Pure miRNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner og deretter lagret ved -80 _C frem til eksperimentet.

Revers transkripsjonsreaksjon For miRNA-analyser ved kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR), vil 100 ng av totalt RNA bli reverstranskribert ved hjelp av TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Alle reaksjoner vil bli utført som spesifisert i produsentens protokoll.

TaqMan low-density arrays TLDA vil bli analysert for å identifisere profilen til differensielt uttrykte miRNA mellom de tre settene med prøver (forbehandling, 7 dager etter behandling, en måned etter behandling). Kort fortalt vil totalt RNA reverstranskriberes til cDNA av TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit og Megaplex RT sett pool A og B versjon 3.0 (Applied Biosystems). RT-produktet vil lastes inn i TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 (Applied Biosystems), som muliggjør samtidig kvantifisering av 667 humane miRNA. TaqMan mikroRNA-analyser og analyser vil bli utført på ABI 7900HT Instrument (Applied Biosystems). Alle reaksjoner ble utført i henhold til standard produsentens protokoller. Kvantitative miRNA-ekspresjonsdata ble innhentet og normalisert ved bruk av ABI 7900HT SDS-programvare (Applied Biosystems).

Kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) Ekspresjon av miRNA detektert via TaqMan lavdensitetsarrayer vil også bli studert i HCC-svulster og/eller deres parede normale levervev ved qRT-PCR-analyse som beskrevet tidligere (Lee et al. ., 2011). RNU6B snRNA ble brukt som en endogen kontroll. Hver mikroRNA-analyse ble utført i tre eksemplarer. Ekspresjon av mikroRNA ble rapportert som delta Ct verdi (Ct verdi av RNU6B - Ct verdi av mål mikroRNA). Etterforskerne definerte gruppene av svulster eller celler med høy eller lav ekspresjon basert på median ekspresjonsverdi for hvert mikroRNA.

Statistisk analyse Total overlevelse og progresjonsfri overlevelse vil bli evaluert ved bruk av Kaplan-Meiers metode. Når et spesifikt protein er identifisert av den proteomiske studien, vil pasientene bli delt inn i høyekspresjonsgruppe og lavekspresjonsgruppe, i henhold til median plasmaekspresjonsnivået til miRNA for alle pasienter; overlevelsesforskjell mellom høyekspresjonsgruppe og lavekspresjonsgruppe vil bli analysert ved hjelp av log-rank test. p-verdi mindre enn 0,05 vil bli ansett som signifikant.