MiRNA als diagnostischer und prognostischer Biomarker für hepatozelluläres Karzinom

Hintergrund:

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die sechsthäufigste Krebserkrankung und die dritthäufigste Krebssterblichkeitsrate weltweit (Kamangar et al., 2006). Zu den Behandlungen des hepatozellulären Karzinoms gehören chirurgische Resektion, lokale Therapien wie Radiofrequenzablation (RFA) und perkutane Ethanolinjektion (PEI), transarterielle Chemoembolisation (TACE) und beste unterstützende Pflege (Bruix und Sherman, 2005). Für Patienten, die nicht für einen chirurgischen Eingriff oder lokale Therapien in Frage kommen, wird Sorafenib empfohlen (Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). Allerdings litten die meisten Patienten auch nach erfolgreicher Behandlung wie einer chirurgischen Resektion unter einem Wiederauftreten oder Fortschreiten des Tumors (Bruix und Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Obwohl mehrere Stadieneinstufungssysteme für HCC entwickelt wurden, wie das Okuda-Stufensystem, das AJCC-System, das BCLC-Stufensystem und das CLIP-Bewertungssystem, ist der prognostische Wert der einzelnen Stadiensysteme nicht konsistent (Chen et al., 2009). und die Anwendbarkeit jedes Stadiensystems hängt von der gewählten Behandlungsmethode ab.

Aufgrund der Unzulänglichkeiten klinischer Staging-Systeme bei der Vorhersage des Ergebnisses von HCC ist es von großem Interesse, nach Serumbiomarkern zu suchen, um die Prognose von HCC vorherzusagen (Fujiyama et al., 2002; Marrero und Lok, 2004). Unter ihnen ist Alpha-Fetoprotein (AFP) das am besten untersuchte. AFP wurde als Marker bei der Diagnose von HCC (Bruix et al., 2001) und als Prognosefaktor für neu diagnostiziertes HCC (1998) verwendet. AFP ist auch als prädiktiver Faktor für das Ansprechen auf eine Chemotherapie von Wert (Chan et al., 2009). Allerdings ist die Anwendbarkeit von AFP bei HCC nach chirurgischer Tumorresektion oder nach lokaler Therapie noch ungewiss. Bei Patienten mit HCC und normalem AFP-Serumspiegel konnte APF nicht als Prognosefaktor herangezogen werden. Andere Biomarker wie Glipecan-3 befinden sich noch in der Entwicklung (Marrero und Lok, 2004).

MicroRNAs (miRNAs), nichtkodierende RNAs mit 17 bis 25 Nukleotiden, sind bei Krebs häufig fehlreguliert und erweisen sich als neuartige nicht-invasive Biomarker für die Krebsvorsorge, Diagnose, Überwachung der Therapiewirksamkeit und Vorhersage der Prognose (Wu et al., 2007). MiRNAs werden im Serum stabil exprimiert, da sie gegenüber endogener RNase resistent sind und sich bei hoher Stabilität leicht lagern lassen (Aref et al., 2014). Mehrere Studien haben eine abnormale Expression menschlicher Serum-miRNAs bei vielen Krebsarten wie Leber-, Darm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs gezeigt (Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). Die Sensitivität von miRNA als diagnostischer Biomarker für HCC könnte bis zu 80 % betragen (Yin et al., 2014). Mithilfe von miRNA-Arrays können miRNA-Signaturen generiert und die Empfindlichkeit und Spezifität von Biomarkern für die Tumordiagnose und Prognosevorhersage weiter verbessert werden.

Testzweck:

1. Identifizierung von Serum-miRNA als Diagnose- oder Vorhersage-Biomarker für HCC.
2. Korrelation mit dem Expressionsniveau von miRNA zwischen Serum, HCC-Tumorgewebe und angrenzendem Nicht-Tumorgewebe.
3. Sammeln und Speichern von Desoxyribonukleinsäure (DNA) für zukünftige explorative Forschungen zu Genen/genetischen Variationen, die das Ansprechen auf die Behandlung bei HCC beeinflussen können.
4. Sammeln und Lagern von überschüssigem Plasma und Tumorgewebe für zukünftige explorative Forschungen zu Proteinen/Genen/genetischen Variationen, die das Ansprechen auf die Behandlung bei HCC beeinflussen können.

Methoden: Studiendesign Dies ist eine prospektive Studie. Alle Patienten müssen eine Einverständniserklärung abgeben. Insgesamt werden 200 Patienten im Alter von > 20 Jahren, bei denen HCC an der National Taiwan University und im Far-Eastern Memorial Hospital diagnostiziert wurde, aufgenommen. Die diagnostischen Kriterien für HCC entsprechen den AASLD-Kriterien von 2011 (Bruix et al., 2011). Kurz gesagt: Knötchen mit einer Größe von mehr als 1 cm, die bei der Ultraschalluntersuchung einer Leberzirrhose gefunden werden, sollten mit einer dynamischen Untersuchung, entweder CT-Scan oder Kontrast-MRT, weiter untersucht werden. Wenn das Erscheinungsbild bei einer Technik typisch für HCC ist (d. h. hypervaskulär mit Auswaschung in der portalen/venösen Phase), würde die Läsion als HCC diagnostiziert werden. Wenn die Befunde nicht charakteristisch sind oder das Gefäßprofil nicht mit den verschiedenen Techniken übereinstimmt, sollte eine Biopsie der Läsion durchgeführt werden. Für das klinische Staging werden bei diesen Patienten zwei Staging-Systeme angewendet, darunter das BCLC-Staging und das klinische TNM-System. Die klinisch-pathologischen Daten werden prospektiv erhoben. Klinische Ergebnisse, einschließlich Behandlungstoxizität, Ansprechen auf die Behandlung gemäß den überarbeiteten RECIST-Kriterien, Krankheitsprogression und Gesamtüberleben, werden aufgezeichnet.

Proben- und Serumentnahme Blutproben werden zu drei Zeitpunkten vor der Behandlung, 7 Tage nach der Behandlung und einen Monat nach der Behandlung entnommen. Blutproben werden bei der Entnahme in Plasma und mononukleäre Zellen getrennt und vor der weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Die Behandlungsmethoden umfassen Operation, TACE, RFA, PEI oder Anti-Angiogenese-Mittel einschließlich der Verwendung von Sorafenib.

Gewebesammlung Die HCC-Gewebe (T) und die entsprechenden Nicht-Tumor-Lebergewebe (NT) werden entnommen. Die chirurgischen Proben werden unmittelbar nach der Operation eingefroren und bei -140 °C gelagert.

Der Virusmarker Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) und der Antikörper gegen HCV (Anti-HCV) werden bei jedem Patienten mit kommerziell erhältlichen Enzymimmunoassay-Kits überprüft. Bei HBsAg-positiven Patienten werden HBeAg und Anti-HBe durch einen enzymgebundenen Immunosorbens-Assay gemessen. Der Serumspiegel der HBV-DNA wird durch die interne TaqMan-Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (PCR) gemessen. Bei Anti-HCV-positiven Patienten wird die HCV-RNA mithilfe der hauseigenen TaqMan-Echtzeit-PCR gemessen

RNA-Isolierung, Reverse Transkription und miRNA-Array. Blutproben werden in EDTA-haltige Röhrchen entnommen und zur Plasmatrennung 15 Minuten lang bei 4.000 x g zentrifugiert. Das Plasma wird in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und erneut 5 Minuten lang bei 12.000 x g zentrifugiert. 200 µl Plasma werden in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. Die RNA wird mit dem High Pure miRNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und dann bis zum Experiment bei -80 °C gelagert.

Reverse Transkriptionsreaktion Für miRNA-Analysen mittels quantitativer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) werden 100 ng Gesamt-RNA mit dem TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) revers transkribiert. Alle Reaktionen werden gemäß den Angaben im Herstellerprotokoll durchgeführt.

TaqMan-TLDA-Arrays mit niedriger Dichte werden analysiert, um das Profil unterschiedlich exprimierter miRNAs zwischen den drei Probensätzen (Vorbehandlung, 7 Tage nach der Behandlung, einen Monat nach der Behandlung) zu identifizieren. Kurz gesagt, Gesamt-RNA wird mit dem TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit und dem Megaplex RT Set Pool A und B Version 3.0 (Applied Biosystems) revers in cDNA transkribiert. Das RT-Produkt wird in das TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 (Applied Biosystems) geladen und ermöglicht so die gleichzeitige Quantifizierung von 667 humanen miRNAs. TaqMan-microRNA-Assays und -Analysen werden auf dem ABI 7900HT-Instrument (Applied Biosystems) durchgeführt. Alle Reaktionen wurden gemäß den Standardprotokollen der Hersteller durchgeführt. Quantitative miRNA-Expressionsdaten wurden mit der ABI 7900HT SDS-Software (Applied Biosystems) erfasst und normalisiert.

Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) Die Expression von miRNA, die über TaqMan-Arrays mit niedriger Dichte nachgewiesen wurde, wird auch in den HCC-Tumoren und/oder ihrem gepaarten normalen Lebergewebe durch qRT-PCR-Analyse untersucht, wie zuvor beschrieben (Lee et al ., 2011). Als endogene Kontrolle wurde RNU6B-snRNA verwendet. Jeder microRNA-Assay wurde dreifach durchgeführt. Die Expression von microRNAs wurde als Delta-Ct-Wert (Ct-Wert von RNU6B – Ct-Wert der Ziel-microRNA) angegeben. Die Forscher definierten die Gruppen von Tumoren oder Zellen mit hoher oder niedriger Expression basierend auf dem mittleren Expressionswert jeder microRNA.

Statistische Analyse Das Gesamtüberleben und das progressionsfreie Überleben werden anhand der Kaplan-Meier-Methode bewertet. Sobald ein spezifisches Protein durch die Proteomstudie identifiziert wurde, werden die Patienten entsprechend dem mittleren Plasmaexpressionsniveau der miRNA aller Patienten in eine Gruppe mit hoher Expression und eine Gruppe mit niedriger Expression eingeteilt; Der Überlebensunterschied zwischen der Gruppe mit hoher Expression und der Gruppe mit niedriger Expression wird mithilfe des Log-Rank-Tests analysiert. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wird als signifikant angesehen.