MiRNA als een diagnostische en prognostische biomarker van hepatocellulair carcinoom

Achtergrond:

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de zesde meest voorkomende vorm van kanker en het derde sterftecijfer van kanker in de wereld (Kamangar et al., 2006). Behandelingen van hepatocellulair carcinoom omvatten chirurgische resectie, lokale therapieën zoals radiofrequente ablatie (RFA) en percutane ethanolinjectie (PEI), transarteriële chemo-embolisatie (TACE) en beste ondersteunende zorg (Bruix en Sherman, 2005). Voor patiënten die niet in aanmerking komen voor chirurgische ingrepen of lokale therapieën, wordt sorafenib aanbevolen (Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). Maar zelfs na een succesvolle behandeling, zoals chirurgische resectie, leden de meeste patiënten aan recidief of progressie van de tumor (Bruix en Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Hoewel er verschillende staging-systemen van HCC zijn ontwikkeld, zoals het Okuda-staging-systeem, het AJCC-systeem, het BCLC-staging-systeem en het CLIP-scoresysteem, is de prognostische waarde van elk staging-systeem niet consistent (Chen et al., 2009). en de toepasbaarheid van elk stadiëringssysteem hangt af van de gekozen behandelingsmethode.

Vanwege de tekortkoming van klinische stadiëringssystemen bij het voorspellen van de uitkomst van HCC, is het van groot belang om serumbiomarkers te doorzoeken om de prognose HCC te voorspellen (Fujiyama et al., 2002; Marrero en Lok, 2004). Onder hen is alfa-fetoproteïne (AFP) het meest goed bestudeerd. AFP is gebruikt als marker bij de diagnose van HCC (Bruix et al., 2001) en als prognostische factor voor nieuw gediagnosticeerde HCC (1998). AFP is ook van waarde als voorspellende factor voor de respons op chemotherapie (Chan et al., 2009). De toepasbaarheid van AFP voor HCC na chirurgische resectie van de tumor of na lokale therapie is echter nog onzeker. Voor patiënten met HCC en een normaal AFP-serumgehalte kon APF geen prognostische factor zijn. Andere biomarkers, zoals glipecan-3, zijn nog in ontwikkeling (Marrero en Lok, 2004).

MicroRNA's (miRNA's), niet-coderende RNA's van 17 tot 25 nucleotiden, worden vaak ontregeld bij kanker en komen naar voren als nieuwe niet-invasieve biomarker voor kankerscreening, diagnose, monitoring van de werkzaamheid van therapie en het voorspellen van prognose (Wu et al., 2007). MiRNA's zijn stabiel tot expressie in serum als hun resistentie tegen endogene RNase en gemakkelijk opslag met hoge stabiliteit (Aref et al., 2014). Verschillende onderzoeken hebben abnormale expressie van menselijke serum-miRNA's aangetoond bij veel kankers, zoals lever-, colorectale en pancreaskanker (Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). De gevoeligheid van miRNA als diagnostische biomarker van HCC kan oplopen tot 80% (Yin et al., 2014). Het gebruik van miRNA-arrays kan miRNA-handtekeningen genereren en de gevoeligheid en specificiteit van biomarkers voor tumordiagnose en prognosevoorspelling verder verbeteren.

Proefdoel:

1. Serum-miRNA identificeren als een diagnose- of voorspellingsbiomarker voor HCC.
2. Om te correleren met het expressieniveau van miRNA tussen serum, HCC-tumorweefsel en aangrenzend niet-tumorweefsel.
3. Om deoxyribonucleïnezuur (DNA) te verzamelen en op te slaan voor toekomstig verkennend onderzoek naar genen/genetische variatie die de respons op behandeling bij HCC kunnen beïnvloeden.
4. Om overtollig plasma en tumorweefsel te verzamelen en op te slaan voor toekomstig verkennend onderzoek naar eiwitten/genen/genetische variatie die de respons op behandeling bij HCC's kunnen beïnvloeden.

Methoden: Onderzoeksopzet Dit is een prospectieve studie. Alle patiënten moeten geïnformeerde toestemmingen geven. In totaal zullen 200 patiënten van >20 jaar oud bij wie de diagnose HCC is gesteld aan de National Taiwan University en het Far-Eastern Memorial Hospital worden ingeschreven. De diagnostische criteria van HCC zijn volgens de AASLD-criteria van 2011 (Bruix et al., 2011). Kortom, knobbeltjes van meer dan 1 cm die bij echografisch onderzoek van een levercirrose worden gevonden, moeten verder worden onderzocht met één dynamische studie, hetzij CT-scan of contrast-MRI. Als het uiterlijk typerend is voor HCC (d.w.z. hypervasculair met wash-out in de portale/veneuze fase) in één techniek, zou de laesie worden gediagnosticeerd als HCC. Als de bevindingen niet kenmerkend zijn of als het vasculaire profiel niet samenvalt tussen technieken, moet de laesie worden gebiopteerd. Voor klinische stadiëring zullen twee stadiëringssystemen op deze patiënten worden toegepast, waaronder BCLC-stadiëring en klinisch TNM-systeem. De klinisch-pathologische gegevens zullen prospectief worden verzameld. Klinische resultaten, inclusief behandelingstoxiciteit, behandelingsrespons zoals gedefinieerd door de herziene RECIST-criteria, ziekteprogressie en algehele overleving zullen worden geregistreerd.

Monster- en serumafname Bloedmonsters worden afgenomen op 3 tijdstippen: voor de behandeling, 7 dagen na de behandeling en een maand na de behandeling. Bloedmonsters worden bij afname gescheiden in plasma en mononucleaire cellen en worden voor verder gebruik opgeslagen in -20Ç. De behandelingsmethoden omvatten operatie, TACE, RFA, PEI of anti-angiogenese-middel inclusief sorafenib-gebruik.

Weefselverzameling De HCC-weefsels (T) en de overeenkomstige niet-tumor leverweefsels (NT) zullen worden verkregen. De chirurgische monsters worden onmiddellijk na de operatie ingevroren en bewaard bij -140°C.

Virale marker Hepatitis B-oppervlakte-antigeen (HBsAg) en antilichaam tegen HCV (anti-HCV) zullen voor elke patiënt worden gecontroleerd met behulp van in de handel verkrijgbare enzymgekoppelde immunosorbant-assaykits. Voor HBsAg-positieve patiënten zullen HBeAg en anti-HBe worden gemeten met een enzymgekoppelde immunosorbenttest. Het serumniveau van HBV-DNA zal worden gemeten door middel van de interne TaqMan real-time polymerasekettingreactie (PCR). Voor anti-HCV-positieve patiënten zal HCV-RNA worden gemeten door middel van in-house TaqMan real-time PCR

RNA-isolatie, reverse transcriptie en miRNA-array Bloedmonsters getrokken in EDTA-bevattende buisjes en 15 minuten gecentrifugeerd bij 4.000 x g voor plasmascheiding. Plasma overgebracht naar een schone microcentrifugebuis en opnieuw gecentrifugeerd bij 12.000 x g gedurende 5 minuten en 200 µl plasma wordt overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis en bewaard bij -80 °C tot analyse. RNA wordt geïsoleerd met behulp van High Pure miRNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant en vervolgens bewaard bij -80 _C tot het experiment.

Omgekeerde transcriptiereactie Voor miRNA-analyses door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR), zal 100 ng totaal RNA omgekeerd worden getranscribeerd met behulp van de TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, VS). Alle reacties worden uitgevoerd zoals gespecificeerd in het protocol van de fabrikant.

TaqMan-arrays met lage dichtheid TLDA zullen worden geanalyseerd om het profiel van differentieel tot expressie gebrachte miRNA's tussen de drie reeksen monsters te identificeren (voorbehandeling, 7 dagen na behandeling, één maand na behandeling). Kortom, totaal RNA wordt reverse-getranscribeerd in cDNA door de TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit en Megaplex RT set pool A en B versie 3.0 (Applied Biosystems). Het RT-product wordt geladen in TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 (Applied Biosystems), waardoor gelijktijdige kwantificering van 667 menselijke miRNA's mogelijk is. TaqMan microRNA-assays en -analyse zullen worden uitgevoerd op het ABI 7900HT-instrument (Applied Biosystems). Alle reacties werden uitgevoerd volgens de standaardprotocollen van de fabrikant. Kwantitatieve miRNA-expressiegegevens werden verkregen en genormaliseerd met behulp van ABI 7900HT SDS-software (Applied Biosystems).

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) Expressie van miRNA gedetecteerd via TaqMan-arrays met lage dichtheid zal ook worden bestudeerd in de HCC-tumoren en/of hun gepaarde normale leverweefsel door middel van qRT-PCR-analyse zoals eerder beschreven (Lee et al. ., 2011). RNU6B-snRNA werd gebruikt als een endogene controle. Elke microRNA-assay werd in drievoud uitgevoerd. Expressie van microRNA's werd gerapporteerd als delta Ct-waarde (Ct-waarde van RNU6B - Ct-waarde van doelwit-microRNA). De onderzoekers definieerden de groepen tumoren of cellen met hoge of lage expressie op basis van de mediane expressiewaarde van elk microRNA.

Statistische analyse Totale overleving en progressievrije overleving zullen worden geëvalueerd met behulp van de methode van Kaplan-Meier. Zodra een specifiek eiwit is geïdentificeerd door de proteomische studie, zullen patiënten worden verdeeld in een groep met een hoge expressie en een groep met een lage expressie, volgens het mediane plasma-expressieniveau van het miRNA van alle patiënten; het overlevingsverschil tussen de groep met hoge expressie en de groep met lage expressie zal worden geanalyseerd met behulp van een log-ranktest. p-waarde kleiner dan 0,05 wordt als significant beschouwd.