MiRNA hepatosellulaarisen karsinooman diagnostisena ja prognostisena biomarkkerina

Tausta:

Hepatosellulaarinen syöpä (HCC) on kuudenneksi yleisin syöpä ja kolmas syöpäkuolleisuus maailmassa (Kamangar et al., 2006). Maksasolukarsinooman hoitoon kuuluvat kirurginen resektio, paikalliset hoidot, kuten radiotaajuusablaatio (RFA) ja perkutaaninen etanoli-injektio (PEI), transarteriaalinen kemoembolisaatio (TACE) ja paras tukihoito (Bruix ja Sherman, 2005). Sorafenibia suositellaan potilaille, jotka eivät ole ehdokkaita kirurgiseen interventioon tai paikalliseen hoitoon (Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). Kuitenkin jopa onnistuneen hoidon, kuten kirurgisen resektion, jälkeen useimmat potilaat kärsivät kasvaimen uusiutumisesta tai etenemisestä (Bruix ja Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Vaikka HCC:lle on kehitetty useita vaiheistusjärjestelmiä, kuten Okuda-vaihejärjestelmä, AJCC-järjestelmä, BCLC-vaihejärjestelmä ja CLIP-pisteytysjärjestelmä, kunkin vaiheistusjärjestelmän ennustearvo ei ole johdonmukainen (Chen et al., 2009). ja kunkin vaiheistusjärjestelmän soveltuvuus riippuu valitusta hoitomenetelmästä.

Koska kliinisissä vaiheistusjärjestelmissä on puutteita HCC:n lopputuloksen ennustamisessa, on erittäin mielenkiintoista etsiä seerumin biomarkkereita HCC-ennusteen ennustamiseksi (Fujiyama et al., 2002; Marrero ja Lok, 2004). Niistä alfafetoproteiini (AFP) on enimmäkseen hyvin tutkittu. AFP:tä on käytetty markkerina HCC:n diagnosoinnissa (Bruix et ai., 2001) ja prognostisena tekijänä äskettäin diagnosoidulle HCC:lle (1998). AFP on arvokas myös kemoterapiavasteen ennustajana (Chan et al., 2009). AFP:n soveltuvuus HCC:hen kasvaimen kirurgisen resektion tai paikallisen hoidon jälkeen on kuitenkin edelleen epävarmaa. Potilaille, joilla on HCC ja normaali seerumin AFP-taso, APF:ää ei voitu käyttää prognostisena tekijänä. Muita biomarkkereita, kuten glipekaani-3:a, kehitetään edelleen (Marrero ja Lok, 2004).

MikroRNA:t (miRNA:t), 17-25 nukleotidin ei-koodaavat RNA:t, ovat usein säätelemättömiä syövässä, ja niistä tulee uusia ei-invasiivisia biomarkkereita syövän seulonnassa, diagnosoinnissa, hoidon tehokkuuden monitoroinnissa ja ennusteen ennustamisessa (Wu et al., 2007). MiRNA:t ilmentyvät stabiilisti seerumissa, koska ne ovat resistenttejä endogeeniselle RNaasille ja helposti säilytettävissä erittäin stabiilina (Aref et al., 2014). Useat tutkimukset ovat osoittaneet ihmisen seerumin miRNA:iden epänormaalia ilmentymistä monissa syövissä, kuten maksa-, paksusuolen- ja haimasyövässä (Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). MiRNA:n herkkyys HCC:n diagnostisena biomarkkerina voi olla jopa 80 % (Yin et al., 2014). MiRNA-ryhmien käyttäminen voi tuottaa miRNA-allekirjoituksia ja parantaa entisestään biomarkkerin herkkyyttä ja spesifisyyttä kasvaindiagnoosissa ja ennusteen ennustamisessa.

Kokeen tarkoitus:

1. Seerumin miRNA:n tunnistaminen HCC:n diagnoosiksi tai ennustebiomarkkeriksi.
2. Korreloida miRNA:n ekspressiotason kanssa seerumin, HCC-kasvainkudoksen ja viereisen ei-kasvainkudoksen välillä.
3. Deoksiribonukleiinihapon (DNA) kerääminen ja varastointi tulevaa tutkimusta varten geeneihin/geneettisiin variaatioihin, jotka voivat vaikuttaa hoitovasteeseen HCC:ssä.
4. Keräämään ja varastoimaan ylimääräisiä plasma- ja kasvainkudoksia tulevaa tutkimusta varten proteiineista/geeneistä/geneettisistä variaatioista, jotka voivat vaikuttaa hoitovasteeseen HCC:issä.

Menetelmät: Tutkimuksen suunnittelu Tämä on prospektiivinen tutkimus. Kaikkien potilaiden on annettava tietoinen suostumus. Kaikkiaan 200 yli 20-vuotiasta potilasta, joilla on diagnosoitu HCC National Taiwanin yliopistossa ja Far-Eastern Memorial Hospitalissa, otetaan mukaan. HCC:n diagnostiset kriteerit ovat vuoden 2011 AASLD-kriteerien mukaisia ​​(Bruix et al., 2011). Lyhyesti sanottuna kirroosisen maksan ultraäänitutkimuksessa löydetyt yli 1 cm:n kyhmyt tulisi tutkia tarkemmin yhdellä dynaamisella tutkimuksella, joko CT-skannauksella tai varjo-MRI:llä. Jos ulkonäkö on tyypillistä HCC:lle (eli hypervaskulaarinen, jossa huuhtoutuminen portaali-/laskimovaiheessa) on yhdessä tekniikassa, leesio diagnosoidaan HCC:ksi. Jos löydökset eivät ole tyypillisiä tai verisuoniprofiili ei ole satunnainen eri tekniikoiden välillä, vauriosta tulee ottaa biopsia. Näihin potilaisiin sovelletaan kliinistä vaiheistusjärjestelmää, mukaan lukien BCLC-vaiheistus ja kliininen TNM-järjestelmä. Kliinispatologiset tiedot kerätään tulevaisuuteen. Kliiniset tulokset, mukaan lukien hoidon toksisuus, hoitovaste tarkistettujen RECIST-kriteerien mukaisesti, taudin eteneminen ja kokonaiseloonjääminen kirjataan.

Näytteen ja seerumin otto Verinäytteet otetaan 3 ajankohtana ennen hoitoa, 7 päivää hoidon jälkeen ja kuukausi hoidon jälkeen. Verinäytteet erotetaan plasma- ja mononukleaarisissa soluissa keräyksen yhteydessä ja säilytetään -20 asteessa ennen jatkokäyttöä. Hoitomenetelmiä ovat leikkaus, TACE, RFA, PEI tai angiogeneesiä estävät aineet, mukaan lukien sorafenibin käyttö.

Kudosten keräys HCC-kudokset (T) ja vastaavat ei-kasvainmaksakudokset (NT) saadaan. Kirurgiset näytteet pakastetaan välittömästi leikkauksen jälkeen ja säilytetään -140°C:ssa.

Viruksen merkkiaine Hepatiitti B:n pinta-antigeeni (HBsAg) ja HCV:n vasta-aine (anti-HCV) tarkistetaan kaupallisesti saatavilla olevilla entsyymikytkentäisillä immunosorbenttimäärityksillä jokaiselle potilaalle. HBsAg-positiiviselle potilaalle HBeAg ja anti-HBe mitataan entsyymikytkentäisellä immunosorbenttimäärityksellä. HBV-DNA:n taso seerumissa mitataan talon TaqManin reaaliaikaisella polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Anti-HCV-positiivisten potilaiden HCV-RNA mitataan talon TaqManin reaaliaikaisella PCR:llä

RNA:n eristäminen, käänteistranskriptio ja miRNA-ryhmä Verinäytteet otettu EDTA:ta sisältäviin putkiin ja sentrifugoitu 4 000 x g 15 minuutin ajan plasman erottamista varten. Plasma siirretään puhtaaseen mikrosentrifugiputkeen ja sentrifugoidaan uudelleen 12 000 x g:llä 5 minuuttia ja 200 ul plasmaa siirretään uuteen mikrosentrifugiputkeen ja säilytetään -80 _C:ssa analyysiin asti. RNA eristetään käyttämällä High Pure miRNA Isolation Kitiä (Roche, Mannheim, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja säilytetään sitten -80 _C:ssa kokeeseen asti.

Käänteistranskriptioreaktio MiRNA-analyysejä varten kvantitatiivisella reaaliaikaisella polymeraasiketjureaktiolla (qRT-PCR) 100 ng kokonais-RNA:ta käänteistranskriptoidaan käyttämällä TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit -sarjaa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Kaikki reaktiot suoritetaan valmistajan protokollan mukaisesti.

TaqManin matalatiheyksiset taulukot TLDA analysoidaan eri tavoin ilmentyneiden miRNA:iden profiilin tunnistamiseksi kolmen näytesarjan välillä (esikäsittely, 7 päivää hoidon jälkeen, kuukausi hoidon jälkeen). Lyhyesti sanottuna kokonais-RNA käänteistranskriptoi cDNA:ksi TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit -sarjan ja Megaplex RT -sarjan poolin A ja B version 3.0 (Applied Biosystems) avulla. RT-tuote ladataan TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0:aan (Applied Biosystems), mikä mahdollistaa 667 ihmisen miRNA:n samanaikaisen kvantifioinnin. TaqMan-mikroRNA-määritykset ja -analyysit suoritetaan ABI 7900HT -laitteella (Applied Biosystems). Kaikki reaktiot suoritettiin valmistajien standardikäytäntöjen mukaisesti. Kvantitatiiviset miRNA-ekspressiotiedot hankittiin ja normalisoitiin käyttämällä ABI 7900HT SDS -ohjelmistoa (Applied Biosystems).

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) TaqManin pienitiheyksisten ryhmien kautta havaitun miRNA:n ilmentymistä tutkitaan myös HCC-kasvaimissa ja/tai niiden normaalissa maksakudoksessa qRT-PCR-analyysillä, kuten aiemmin on kuvattu (Lee et al. ., 2011). RNU6B snRNA:ta käytettiin endogeenisenä kontrollina. Jokainen mikroRNA-määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. MikroRNA:iden ilmentyminen ilmoitettiin delta-Ct-arvona (RNU6B:n Ct-arvo - kohdemikroRNA:n Ct-arvo). Tutkijat määrittelivät kasvainten tai solujen ryhmät, joilla on korkea tai alhainen ekspressio kunkin mikroRNA:n mediaaniekspressioarvon perusteella.

Tilastollinen analyysi Kokonaiseloonjääminen ja etenemisvapaa eloonjääminen arvioidaan Kaplan-Meierin menetelmällä. Kun spesifinen proteiini on tunnistettu proteomisessa tutkimuksessa, potilaat jaetaan korkean ilmentymisen ryhmään ja alhaisen ilmentymisen ryhmään kaikkien potilaiden miRNA:n plasmaekspressiotason mediaanin mukaan; eloonjäämisero korkean ilmentymisen ryhmän ja alhaisen ekspression ryhmän välillä analysoidaan log-rank-testillä. p-arvo, joka on pienempi kuin 0,05, katsotaan merkitseväksi.