MiRNA como Biomarcador Diagnóstico e Prognóstico do Carcinoma Hepatocelular

Fundo:

O carcinoma hepatocelular (CHC) é o sexto câncer mais comum e a terceira taxa de mortalidade por câncer no mundo (Kamangar et al., 2006). Os tratamentos do carcinoma hepatocelular incluem ressecção cirúrgica, terapias locais, como ablação por radiofrequência (RFA) e injeção percutânea de etanol (PEI), quimioembolização transarterial (TACE) e melhores cuidados de suporte (Bruix e Sherman, 2005). Para pacientes que não são candidatos a intervenção cirúrgica ou terapias locais, o sorafenibe é recomendado (Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). No entanto, mesmo após o tratamento bem-sucedido, como a ressecção cirúrgica, a maioria dos pacientes sofreu recorrência ou progressão do tumor (Bruix e Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Embora vários sistemas de estadiamento do CHC tenham sido desenvolvidos, como o sistema de estadiamento Okuda, o sistema AJCC, o sistema de estadiamento BCLC e o sistema de pontuação CLIP, o valor prognóstico de cada sistema de estadiamento não é consistente (Chen et al., 2009), e a aplicabilidade de cada sistema de estadiamento depende da metodologia de tratamento selecionada.

Devido à deficiência dos sistemas de estadiamento clínico em prever o resultado do CHC, é de grande interesse pesquisar biomarcadores séricos para prever o prognóstico do CHC (Fujiyama et al., 2002; Marrero e Lok, 2004). Dentre eles, a alfa-fetoproteína (AFP) é a mais bem estudada. A AFP tem sido usada como marcador no diagnóstico de CHC (Bruix et al., 2001) e como fator prognóstico para CHC recém-diagnosticado (1998). A AFP também é valiosa como fator preditivo para a resposta à quimioterapia (Chan et al., 2009). No entanto, a aplicabilidade da AFP para HCC após a ressecção cirúrgica do tumor ou após a terapia local ainda é incerta. Para pacientes com CHC e nível sérico normal de AFP, o APF não pode ser usado como fator prognóstico. Outros biomarcadores, como o glipecan-3, ainda estão em desenvolvimento (Marrero e Lok, 2004).

MicroRNAs (miRNAs), RNAs não codificantes de 17 a 25 nucleotídeos, são frequentemente desregulados no câncer e emergindo como novos biomarcadores não invasivos para triagem, diagnóstico, monitoramento da eficácia da terapia e prognóstico do câncer (Wu et al., 2007). Os miRNAs são expressos de forma estável no soro como sua resistência à RNase endógena e facilmente armazenados com alta estabilidade (Aref et al., 2014). Vários estudos mostraram expressão anormal de miRNAs séricos humanos em muitos tipos de câncer, como câncer de fígado, colorretal e pancreático (Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). A sensibilidade do miRNA como um biomarcador de diagnóstico de CHC pode ser de até 80% (Yin et al., 2014). O uso de matrizes de miRNA pode gerar assinaturas de miRNA e melhorar ainda mais a sensibilidade e a especificidade do biomarcador para diagnóstico de tumor e previsão de prognóstico.

Finalidade do teste:

1. Identificar o miRNA sérico como um biomarcador de diagnóstico ou predição para CHC.
2. Correlacionar com o nível de expressão de miRNA entre soro, tecido tumoral HCC e tecido não tumoral adjacente.
3. Coletar e armazenar ácido desoxirribonucleico (DNA) para futuras pesquisas exploratórias sobre genes/variações genéticas que possam influenciar a resposta ao tratamento no CHC.
4. Coletar e armazenar plasma excedente e tecidos tumorais para futuras pesquisas exploratórias sobre proteínas/genes/variação genética que possam influenciar a resposta ao tratamento em HCCs.

Métodos: Desenho do estudo Este é um estudo prospectivo. Todos os pacientes precisam fornecer consentimentos informados. Um total de 200 pacientes com mais de 20 anos de idade diagnosticados com CHC na Universidade Nacional de Taiwan e no Far-Eastern Memorial Hospital serão inscritos. Os critérios de diagnóstico do CHC estão de acordo com os critérios da AASLD de 2011 (Bruix et al., 2011). Em resumo, nódulos com mais de 1 cm encontrados na triagem ultrassonográfica de um fígado cirrótico devem ser investigados com estudos dinâmicos, tomografia computadorizada ou ressonância magnética com contraste. Se a aparência for típica de CHC (ou seja, hipervascular com washout na fase portal/venosa) em uma técnica, a lesão seria diagnosticada como CHC. Se os achados não forem característicos ou o perfil vascular não for coincidente entre as técnicas, a lesão deve ser biopsiada. Para o estadiamento clínico, dois sistemas de estadiamento serão aplicados a esses pacientes, incluindo o estadiamento BCLC e o sistema clínico TNM. Os dados clínico-patológicos serão coletados prospectivamente. Os resultados clínicos, incluindo a toxicidade do tratamento, a resposta ao tratamento conforme definido pelos critérios RECIST revisados, a progressão da doença e a sobrevida global serão registrados.

Coleta de amostra e soro Amostras de sangue serão coletadas em 3 pontos de tempo - pré-tratamento, 7 dias após o tratamento e um mês após o tratamento. As amostras de sangue serão separadas em plasma e células mononucleares após a coleta e serão armazenadas em -20ºC antes de serem utilizadas. Os métodos de tratamento incluem operação, TACE, RFA, PEI ou agente antiangiogênese, incluindo o uso de sorafenibe.

Coleta de tecidos Serão obtidos os tecidos do CHC (T) e os correspondentes tecidos hepáticos não tumorais (NT). As peças cirúrgicas serão congeladas imediatamente após a cirurgia e armazenadas a -140°C.

Marcador viral O antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e o anticorpo para HCV (anti-HCV) serão verificados usando kits de ensaio de imunoabsorção enzimática disponíveis comercialmente para cada paciente. Para paciente HBsAg positivo, HBeAg e anti-HBe serão medidos por ensaio imunoenzimático. O nível sérico de DNA do VHB será medido pela reação em cadeia da polimerase (PCR) TaqMan em tempo real. Para pacientes anti-HCV positivos, o RNA do HCV será medido por PCR em tempo real TaqMan interno

Isolamento de RNA, transcrição reversa e matriz de miRNA Amostras de sangue coletadas em tubos contendo EDTA e centrifugadas a 4.000 x g por 15 minutos para separação do plasma. O plasma transferido para um tubo de microcentrífuga limpo e centrifugado novamente a 12.000x g por 5 min e 200 ul de plasma serão transferidos para um novo tubo de microcentrífuga e armazenados a -80 _C até a análise. O RNA será isolado usando o High Pure miRNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante e armazenado a -80 _C até o experimento.

Reação de transcrição reversa Para análises de miRNA por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR), 100 ng de RNA total serão transcritos reversamente usando o TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Todas as reações serão realizadas conforme especificado no protocolo do fabricante.

TaqMan low-density arrays TLDA serão analisados ​​para identificar o perfil de miRNAs expressos diferencialmente entre os três conjuntos de amostras (pré-tratamento, 7 dias pós-tratamento, um mês pós-tratamento). Em resumo, o RNA total será transcrito de forma reversa em cDNA pelo TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit e Megaplex RT set pool A e B versão 3.0 (Applied Biosystems). O produto RT será carregado no TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 (Applied Biosystems), permitindo a quantificação simultânea de 667 miRNAs humanos. Os ensaios e análises de microRNA TaqMan serão realizados no Instrumento ABI 7900HT (Applied Biosystems). Todas as reações foram realizadas de acordo com os protocolos padrão dos fabricantes. Dados quantitativos de expressão de miRNA foram adquiridos e normalizados usando o software ABI 7900HT SDS (Applied Biosystems).

PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) A expressão de miRNA detectado via matrizes de baixa densidade TaqMan também será estudada nos tumores HCC e/ou em seu tecido hepático normal pareado por análise qRT-PCR conforme descrito anteriormente (Lee et al ., 2011). RNU6B snRNA foi usado como controle endógeno. Cada ensaio de microRNA foi realizado em triplicado. A expressão de microRNAs foi relatada como valor delta Ct (valor Ct de RNU6B - valor Ct do microRNA alvo). Os pesquisadores definiram os grupos de tumores ou células com alta ou baixa expressão com base no valor médio de expressão de cada microRNA.

Análise estatística A sobrevida global e a sobrevida livre de progressão serão avaliadas pelo método de Kaplan-Meier. Uma vez identificada uma proteína específica pelo estudo proteômico, os pacientes serão divididos em grupo de alta expressão e grupo de baixa expressão, de acordo com a mediana do nível de expressão plasmática do miRNA de todos os pacientes; a diferença de sobrevivência entre o grupo de alta expressão e o grupo de baixa expressão será analisada usando o teste de log-rank. p-valor inferior a 0,05 será considerado significativo.