МикроРНК как диагностический и прогностический биомаркер гепатоцеллюлярной карциномы

Фон:

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является шестым наиболее распространенным видом рака и третьим по смертности от рака в мире (Kamangar et al., 2006). Лечение гепатоцеллюлярной карциномы включает хирургическую резекцию, местную терапию, такую ​​как радиочастотная абляция (РЧА) и чрескожная инъекция этанола (ЧЭИ), трансартериальную химиоэмболизацию (ТАХЭ) и наилучшую поддерживающую терапию (Bruix and Sherman, 2005). Для пациентов, которые не являются кандидатами на хирургическое вмешательство или местную терапию, рекомендуется сорафениб (Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). Однако даже после успешного лечения, такого как хирургическая резекция, у большинства пациентов наблюдался рецидив или прогрессирование опухоли (Bruix and Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Хотя было разработано несколько систем стадирования ГЦК, таких как система стадирования Окуда, система AJCC, система стадирования BCLC и система подсчета очков CLIP, прогностическая ценность каждой системы стадирования несовместима (Chen et al., 2009). и применимость каждой системы стадирования зависит от выбранной методологии лечения.

Из-за недостатков систем клинической стадии в прогнозировании исхода ГЦК большой интерес представляет поиск биомаркеров сыворотки для прогнозирования прогноза ГЦК (Fujiyama et al., 2002; Marrero and Lok, 2004). Среди них наиболее хорошо изучен альфа-фетопротеин (АФП). АФП использовался в качестве маркера при диагностике ГЦК (Bruix et al., 2001) и как прогностический фактор для впервые диагностированного ГЦК (1998). АФП также имеет значение как прогностический фактор ответа на химиотерапию (Chan et al., 2009). Однако применимость АФП при ГЦК после хирургической резекции опухоли или после местной терапии остается неопределенной. Для пациентов с ГЦР и нормальным уровнем АФП в сыворотке крови АФП нельзя было использовать в качестве прогностического фактора. Другие биомаркеры, такие как глипекан-3, все еще находятся в стадии разработки (Marrero and Lok, 2004).

МикроРНК (миРНК), некодирующие РНК длиной от 17 до 25 нуклеотидов, часто нарушаются при раке и становятся новым неинвазивным биомаркером для скрининга рака, диагностики, мониторинга эффективности терапии и прогнозирования прогноза (Wu et al., 2007). МиРНК стабильно экспрессируются в сыворотке, поскольку они устойчивы к эндогенной РНКазе и легко хранятся с высокой стабильностью (Aref et al., 2014). Несколько исследований показали аномальную экспрессию miRNAs сыворотки человека при многих видах рака, таких как рак печени, колоректальный рак и рак поджелудочной железы (Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). Чувствительность микроРНК как диагностического биомаркера ГЦК может достигать 80% (Yin et al., 2014). Использование массивов микроРНК может генерировать сигнатуры микроРНК и дополнительно улучшать чувствительность и специфичность биомаркеров для диагностики опухолей и прогнозирования прогноза.

Цель испытания：

1. Идентифицировать микроРНК сыворотки в качестве биомаркера диагностики или прогнозирования ГЦК.
2. Коррелировать с уровнем экспрессии миРНК между сывороткой, опухолевой тканью ГЦР и прилегающей неопухолевой тканью.
3. Собрать и сохранить дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) для будущих поисковых исследований генов/генетических вариаций, которые могут влиять на реакцию на лечение ГЦК.
4. Собирать и хранить излишки плазмы и опухолевых тканей для будущих поисковых исследований белков/генов/генетических вариаций, которые могут влиять на реакцию на лечение при ГЦР.

Методы： Дизайн исследования Это проспективное исследование. Все пациенты должны предоставить информированное согласие. Всего будет зарегистрировано 200 пациентов в возрасте старше 20 лет с диагнозом ГЦР в Национальном тайваньском университете и Дальневосточной мемориальной больнице. Диагностические критерии ГЦК соответствуют критериям AASLD 2011 года (Bruix et al., 2011). Вкратце, узлы более 1 см, обнаруженные при ультразвуковом скрининге цирроза печени, следует дополнительно исследовать с помощью одного динамического исследования, либо КТ, либо контрастной МРТ. Если внешний вид типичен для ГЦК (т. е. гиперваскулярный с вымыванием в портальную/венозную фазу) при одном методе, поражение будет диагностировано как ГЦК. Если результаты не являются характерными или сосудистый профиль не совпадает с методами, следует провести биопсию поражения. Для клинического стадирования к этим пациентам будут применяться две системы стадирования, включая стадирование BCLC и клиническую систему TNM. Клинико-патологические данные будут собираться проспективно. Клинические исходы, включая токсичность лечения, ответ на лечение согласно пересмотренным критериям RECIST, прогрессирование заболевания и общую выживаемость, будут регистрироваться.

Сбор образцов и сыворотки Образцы крови будут собираться в 3 временных точках: до лечения, через 7 дней после лечения и через месяц после лечения. Образцы крови будут разделены на плазму и мононуклеары при сборе и будут храниться при температуре -20°С до дальнейшего использования. Методы лечения включают операцию, ТАХЭ, РЧА, ЧИЭ или антиангиогенные препараты, включая использование сорафениба.

Сбор тканей Будут получены ткани HCC (T) и соответствующие неопухолевые ткани печени (NT). Хирургические образцы будут заморожены сразу после операции и храниться при температуре -140°C.

Вирусный маркер поверхностного антигена гепатита В (HBsAg) и антитела к ВГС (анти-ВГС) будут проверены с использованием имеющихся в продаже наборов для твердофазного иммуноферментного анализа у каждого пациента. Для HBsAg-позитивных пациентов HBeAg и анти-HBe будут измеряться с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Уровень ДНК HBV в сыворотке будет измеряться с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени TaqMan. Для анти-ВГС-позитивных пациентов РНК ВГС будет измеряться с помощью ПЦР в реальном времени TaqMan.

Выделение РНК, обратная транскрипция и массив микроРНК Образцы крови набирают в пробирки, содержащие ЭДТА, и центрифугируют при 4000xg в течение 15 минут для отделения плазмы. Плазму переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и снова центрифугируют при 12 000 x g в течение 5 мин, а 200 мкл плазмы переносят в новую микроцентрифужную пробирку и хранят при -80 _C до анализа. РНК выделяют с использованием набора для выделения микроРНК High Pure (Roche, Мангейм, Германия) в соответствии с инструкциями производителя, а затем хранят при температуре -80 _C до эксперимента.

Реакция обратной транскрипции Для анализа микроРНК с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) 100 нг общей РНК будут подвергнуты обратной транскрипции с использованием набора TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США). Все реакции будут проводиться, как указано в протоколе производителей.

Массивы TaqMan с низкой плотностью TLDA будут проанализированы для определения профиля дифференциально экспрессируемых микроРНК между тремя наборами образцов (до лечения, через 7 дней после лечения, через один месяц после лечения). Вкратце, общая РНК будет обратно транскрибирована в кДНК с помощью набора TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit и пула наборов Megaplex RT A и B версии 3.0 (Applied Biosystems). Продукт RT будет загружен в набор карт TaqMan Array Human MicroRNA A+B v3.0 (Applied Biosystems), что позволит проводить одновременный количественный анализ 667 микроРНК человека. Анализы и анализ микроРНК TaqMan будут выполняться на приборе ABI 7900HT (Applied Biosystems). Все реакции проводили по стандартным протоколам производителей. Количественные данные экспрессии микроРНК были получены и нормализованы с использованием программного обеспечения ABI 7900HT SDS (Applied Biosystems).

Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Экспрессия миРНК, обнаруженная с помощью массивов TaqMan с низкой плотностью, также будет изучаться в опухолях HCC и/или их парных нормальных тканях печени с помощью анализа qRT-PCR, как описано ранее (Lee et al. ., 2011). В качестве эндогенного контроля использовали мяРНК RNU6B. Каждый анализ микроРНК проводили в трех повторах. Об экспрессии микроРНК сообщали как значение дельта Ct (значение Ct RNU6B - значение Ct микроРНК-мишени). Исследователи определили группы опухолей или клеток с высокой или низкой экспрессией на основе среднего значения экспрессии каждой микроРНК.

Статистический анализ Общая выживаемость и выживаемость без прогрессирования будут оцениваться с использованием метода Каплана-Мейера. Как только конкретный белок будет идентифицирован с помощью протеомного исследования, пациенты будут разделены на группу с высокой экспрессией и группу с низкой экспрессией в соответствии со средним уровнем экспрессии микроРНК в плазме всех пациентов; Разница в выживаемости между группой с высокой экспрессией и группой с низкой экспрессией будет проанализирована с использованием теста логарифмического ранга. p-значение менее 0,05 будет считаться значимым.