MiRNA som en diagnostisk og prognostisk biomarkør for hepatocellulært karcinom

Baggrund:

Hepatocellulært karcinom (HCC) er den sjette mest almindelige kræftsygdom og den tredje dødelighed af kræft i verden (Kamangar et al., 2006). Behandlinger af hepatocellulært karcinom omfatter kirurgisk resektion, lokale terapier såsom radiofrekvensablation (RFA) og perkutan ethanolinjektion (PEI), transarteriel kemoembolisering (TACE) og bedste støttende behandling (Bruix og Sherman, 2005). Til patienter, som ikke er kandidater til kirurgisk indgreb eller lokale terapier, anbefales sorafenib (Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). Men selv efter vellykket behandling såsom kirurgisk resektion led de fleste patienter af tilbagefald eller progression af tumoren (Bruix og Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Selvom der er udviklet flere iscenesættelsessystemer af HCC, såsom Okuda iscenesættelsessystemet, AJCC-systemet, BCLC iscenesættelsessystemet og CLIP-scoringsystemet, er den prognostiske værdi af hvert iscenesættelsessystem ikke konsistent (Chen et al., 2009), og anvendeligheden af ​​hvert iscenesættelsessystem afhænger af den valgte behandlingsmetodologi.

På grund af manglerne ved kliniske stadiesystemer til at forudsige resultatet af HCC, er det af stor interesse at søge i serumbiomarkører for at forudsige prognosen for HCC (Fujiyama et al., 2002; Marrero og Lok, 2004). Blandt dem er alfa-føtoprotein (AFP) det mest velundersøgte. AFP er blevet brugt som en markør ved diagnosticering af HCC (Bruix et al., 2001) og som en prognostisk faktor for nydiagnosticeret HCC(1998). AFP er også af værdi som en forudsigende faktor for kemoterapirespons (Chan et al., 2009). Imidlertid er anvendeligheden af ​​AFP til HCC efter kirurgisk resektion af tumor eller efter lokal terapi stadig usikker. For patienter med HCC og normalt serumniveau af AFP kunne APF ikke bruges som en prognostisk faktor. Andre biomarkører, såsom glipecan-3, er stadig under udvikling (Marrero og Lok, 2004).

MikroRNA'er (miRNA'er), 17- til 25-nukleotider ikke-kodende RNA'er, er ofte dysregulerede i kræft og dukker op som en ny ikke-invasiv biomarkør til kræftscreening, diagnose, overvåg terapieffektivitet og forudsigelse af prognose (Wu et al., 2007). MiRNA'er udtrykkes stabilt i serum som deres resistens over for endogen RNase og opbevares let med høj stabilitet (Aref et al., 2014). Adskillige undersøgelser har vist unormal ekspression af humane serum miRNA'er i mange kræftformer såsom lever-, kolorektal- og bugspytkirtelkræft (Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). Følsomheden af ​​miRNA som en diagnostisk biomarkør for HCC kan være op til 80 % (Yin et al., 2014). Brug af miRNA-arrays kan generere miRNA-signaturer og yderligere forbedre følsomheden og specificiteten af ​​biomarkør til tumordiagnose og prognose forudsigelse.

Formål med forsøg:

1. At identificere serum miRNA som en diagnose eller forudsigelse biomarkør for HCC.
2. At korrelere med ekspressionsniveauet af miRNA mellem serum, HCC-tumorvæv og tilstødende ikke-tumorvæv.
3. At indsamle og opbevare deoxyribonukleinsyre (DNA) til fremtidig udforskende forskning i gener/genetisk variation, der kan påvirke respons på behandling i HCC.
4. At indsamle og opbevare overskydende plasma- og tumorvæv til fremtidig eksplorativ forskning i proteiner/gener/genetisk variation, der kan påvirke respons på behandling i HCC'er.

Metoder: Undersøgelsesdesign Dette er en prospektiv undersøgelse. Alle patienter skal give informeret samtykke. I alt 200 patienter i alderen >20 år, som er diagnosticeret med HCC på National Taiwan University og Far-Eastern Memorial Hospital, vil blive tilmeldt. De diagnostiske kriterier for HCC er i henhold til 2011 AASLD-kriterier (Bruix et al., 2011). Kort sagt, knuder på mere end 1 cm fundet ved ultralydsscreening af en skrumpelever bør undersøges nærmere med én dynamisk undersøgelse, enten CT-scanning eller kontrast-MR. Hvis udseendet er typisk for HCC (dvs. hypervaskulært med udvaskning i den portale/venøse fase) i én teknik, vil læsionen blive diagnosticeret som HCC. Hvis resultaterne ikke er karakteristiske, eller den vaskulære profil ikke er tilfældig blandt teknikkerne, bør læsionen biopsieres. Til klinisk stadieinddeling vil to stadiesystemer blive anvendt på disse patienter, herunder BCLC stadieinddeling og klinisk TNM system. De klinisk-patologiske data vil blive indsamlet prospektivt. Kliniske resultater, herunder behandlingstoksicitet, behandlingsrespons som defineret af de reviderede RECIST-kriterier, sygdomsprogression og samlet overlevelse vil blive registreret.

Prøve- og serumindsamling Blodprøver vil blive indsamlet på 3 tidspunkter før behandling, 7 dage efter behandling og en måned efter behandling. Blodprøver vil blive adskilt i plasma og mononukleære celler ved opsamling og vil blive opbevaret i -20°C før videre brug. Behandlingsmetoderne omfatter operation, TACE, RFA, PEI eller anti-angiogenesemiddel, herunder brug af sorafenib.

Vævsopsamling HCC-vævet (T) og det tilsvarende ikke-tumor-levervæv (NT) vil blive opnået. De kirurgiske prøver vil blive frosset ned umiddelbart efter operationen og opbevaret ved -140°C.

Viral markør Hepatitis B overfladeantigen (HBsAg) og antistof mod HCV (anti-HCV) vil blive kontrolleret ved hjælp af kommercielt tilgængelige enzymkoblede immunsorbentanalysesæt til hver patient. For HBsAg-positive patienter vil HBeAg og anti-HBe blive målt ved enzymkoblet immunosorbant-assay. Serumniveauet af HBV-DNA vil blive målt ved hjælp af TaqMan-realtidspolymerasekædereaktion (PCR). For anti-HCV-positive patienter vil HCV-RNA blive målt ved in-house TaqMan real-time PCR

RNA-isolering, revers transkription og miRNA-array Blodprøver udtaget i EDTA-holdige rør og centrifugeret ved 4.000 x g i 15 minutter til plasmaseparation. Plasma overført til et rent mikrocentrifugerør og centrifugeret igen ved 12.000 x g i 5 minutter, og 200 ul plasma overføres til et nyt mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 _C indtil analyse. RNA vil isoleres ved hjælp af High Pure miRNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Tyskland) i henhold til producentens instruktioner og derefter opbevaret ved -80 _C indtil eksperimentet.

Omvendt transkriptionsreaktion Til miRNA-analyser ved kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion (qRT-PCR) vil 100 ng total RNA blive omvendt transskriberet ved hjælp af TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Alle reaktioner vil blive udført som specificeret i producentens protokol.

TaqMan low-density arrays TLDA vil blive analyseret for at identificere profilen af ​​differentielt udtrykte miRNA'er mellem de tre sæt prøver (forbehandling, 7 dage efter behandling, en måned efter behandling). Kort fortalt vil total RNA reverstransskriberes til cDNA af TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit og Megaplex RT sæt pulje A og B version 3.0 (Applied Biosystems). RT-produktet indlæses i TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 (Applied Biosystems), hvilket muliggør samtidig kvantificering af 667 humane miRNA'er. TaqMan mikroRNA-analyser og -analyse vil blive udført på ABI 7900HT-instrumentet (Applied Biosystems). Alle reaktioner blev udført i overensstemmelse med standardproducenternes protokoller. Kvantitative miRNA-ekspressionsdata blev erhvervet og normaliseret ved hjælp af ABI 7900HT SDS-software (Applied Biosystems).

Kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) Ekspression af miRNA påvist via TaqMan-lavdensitets-arrays vil også blive undersøgt i HCC-tumorerne og/eller deres parrede normale levervæv ved qRT-PCR-analyse som beskrevet tidligere (Lee et al. ., 2011). RNU6B snRNA blev brugt som en endogen kontrol. Hvert mikroRNA-assay blev udført i tre eksemplarer. Ekspression af mikroRNA'er blev rapporteret som delta Ct-værdi (Ct-værdi af RNU6B - Ct-værdi for målmikroRNA). Forskerne definerede grupperne af tumorer eller celler med høj eller lav ekspression baseret på medianekspressionsværdien af ​​hvert mikroRNA.

Statistisk analyse Samlet overlevelse og progressionsfri overlevelse vil blive evalueret ved hjælp af Kaplan-Meiers metode. Når et specifikt protein er identificeret af den proteomiske undersøgelse, vil patienterne blive opdelt i højekspressionsgruppe og lavekspressionsgruppe i henhold til medianplasmaekspressionsniveauet af miRNA'et for alle patienter; overlevelsesforskel mellem højekspressionsgruppe og lavekspressionsgruppe vil blive analyseret ved hjælp af log-rank test. p-værdi mindre end 0,05 vil blive betragtet som signifikant.