MiRNA jako diagnostyczny i prognostyczny biomarker raka wątrobowokomórkowego

Tło:

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest szóstym najczęściej występującym nowotworem i trzecim wskaźnikiem śmiertelności z powodu raka na świecie (Kamangar i in., 2006). Leczenie raka wątrobowokomórkowego obejmuje resekcję chirurgiczną, terapie miejscowe, takie jak ablacja prądem o częstotliwości radiowej (RFA) i przezskórne wstrzyknięcie etanolu (PEI), chemoembolizacja przeztętnicza (TACE) oraz najlepsze leczenie podtrzymujące (Bruix i Sherman, 2005). W przypadku pacjentów, którzy nie są kandydatami do interwencji chirurgicznej lub terapii miejscowej, zalecany jest sorafenib (Cheng i in., 2009; Llovet i in., 2008). Jednak nawet po skutecznym leczeniu, takim jak resekcja chirurgiczna, większość pacjentów cierpiała na nawrót lub progresję guza (Bruix i Sherman, 2005; Llovet i in., 2002; Llovet i in., 2008). Chociaż opracowano kilka systemów stopniowania HCC, takich jak system stopniowania Okuda, system AJCC, system stopniowania BCLC i system punktacji CLIP, wartość prognostyczna każdego systemu stopniowania nie jest spójna (Chen i in., 2009), a możliwość zastosowania każdego systemu stopniowania zależy od wybranej metodologii leczenia.

Ze względu na wady systemów oceny klinicznej w przewidywaniu wyniku HCC, bardzo interesujące jest poszukiwanie biomarkerów surowicy w celu przewidywania rokowania HCC (Fujiyama i in., 2002; Marrero i Lok, 2004). Wśród nich najlepiej zbadana jest alfa-fetoproteina (AFP). AFP stosowano jako marker w diagnozowaniu HCC (Bruix i in., 2001) oraz jako czynnik prognostyczny dla nowo zdiagnozowanego HCC (1998). AFP jest również wartościowym czynnikiem predykcyjnym odpowiedzi na chemioterapię (Chan i in., 2009). Jednak przydatność AFP w przypadku HCC po chirurgicznej resekcji guza lub po leczeniu miejscowym jest nadal niepewna. U pacjentów z HCC i prawidłowym poziomem AFP w surowicy nie można było uznać APF za czynnik prognostyczny. Inne biomarkery, takie jak glipekan-3, są nadal w fazie rozwoju (Marrero i Lok, 2004).

MikroRNA (miRNA), niekodujące RNA o długości od 17 do 25 nukleotydów, są często rozregulowane w raku i pojawiają się jako nowy nieinwazyjny biomarker do badań przesiewowych raka, diagnozy, monitorowania skuteczności terapii i przewidywania rokowania (Wu i in., 2007). MiRNA ulegają stabilnej ekspresji w surowicy ze względu na swoją odporność na endogenne RNazy i łatwe przechowywanie z wysoką stabilnością (Aref i in., 2014). Kilka badań wykazało nieprawidłową ekspresję miRNA ludzkiej surowicy w wielu nowotworach, takich jak rak wątroby, jelita grubego i trzustki (Huang i in., 2010; Liu i in., 2012; Qi i in., 2013). Czułość miRNA jako biomarkera diagnostycznego HCC może sięgać nawet 80% (Yin i wsp., 2014). Korzystanie z macierzy miRNA może generować sygnatury miRNA i dalej poprawiać czułość i specyficzność biomarkerów do diagnozowania nowotworów i przewidywania rokowania.

Cel próby:

1. Identyfikacja miRNA surowicy jako biomarkera diagnostycznego lub prognostycznego dla HCC.
2. Aby skorelować z poziomem ekspresji miRNA między surowicą, tkanką nowotworową HCC i przylegającą tkanką nienowotworową.
3. Gromadzenie i przechowywanie kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) do przyszłych badań eksploracyjnych nad genami/zmiennością genetyczną, które mogą wpływać na odpowiedź na leczenie HCC.
4. Gromadzenie i przechowywanie nadwyżek osocza i tkanek nowotworowych do przyszłych badań eksploracyjnych nad białkami/genami/zmiennością genetyczną, które mogą wpływać na odpowiedź na leczenie HCC.

Metody: Projekt badania Jest to badanie prospektywne. Wszyscy pacjenci muszą wyrazić świadomą zgodę. Do badania zostanie włączonych łącznie 200 pacjentów w wieku >20 lat, u których zdiagnozowano HCC w National Taiwan University i Far-Eastern Memorial Hospital. Kryteria diagnostyczne HCC są zgodne z kryteriami AASLD z 2011 r. (Bruix i in., 2011). W skrócie, guzki większe niż 1 cm wykryte w badaniu ultrasonograficznym wątroby z marskością wątroby powinny być dalej badane za pomocą jednego badania dynamicznego, tomografii komputerowej lub rezonansu magnetycznego z kontrastem. Jeśli wygląd jest typowy dla HCC (tj. hipernaczyniowy z wypłukaniem w fazie wrotnej/żylnej) w jednej technice, zmiana zostanie zdiagnozowana jako HCC. Jeśli wyniki nie są charakterystyczne lub profil naczyniowy nie jest zbieżny między technikami, zmiana powinna zostać poddana biopsji. Do oceny stopnia zaawansowania klinicznego u tych pacjentów zostaną zastosowane dwa systemy stopniowania, w tym stopień zaawansowania BCLC i kliniczny system TNM. Dane kliniczno-patologiczne będą zbierane prospektywnie. Wyniki kliniczne, w tym toksyczność leczenia, odpowiedź na leczenie zdefiniowana przez zmienione kryteria RECIST, postęp choroby i całkowity czas przeżycia zostaną zarejestrowane.

Pobieranie próbek i surowicy Próbki krwi będą pobierane w 3 punktach czasowych — przed leczeniem, 7 dni po leczeniu i jeden miesiąc po leczeniu. Po pobraniu próbki krwi zostaną rozdzielone na osocze i komórki jednojądrzaste i będą przechowywane w temperaturze -20°C przed dalszym użyciem. Metody leczenia obejmują operację, TACE, RFA, PEI lub środek antyangiogenetyczny, w tym użycie sorafenibu.

Pobieranie tkanek Pobrane zostaną tkanki HCC (T) i odpowiadające im nienowotworowe tkanki wątroby (NT). Próbki chirurgiczne zostaną zamrożone natychmiast po zabiegu i przechowywane w temperaturze -140°C.

Marker wirusowy Antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) i przeciwciała przeciwko HCV (anty-HCV) będą sprawdzane przy użyciu dostępnych w handlu zestawów testów immunoenzymatycznych dla każdego pacjenta. W przypadku pacjentów z dodatnim wynikiem HBsAg, HBeAg i anty-HBe zostaną zmierzone za pomocą testu immunoenzymatycznego. Poziom DNA HBV w surowicy będzie mierzony za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym TaqMan. W przypadku pacjentów z dodatnim wynikiem anty-HCV miano RNA HCV zostanie zmierzone za pomocą wewnętrznego PCR w czasie rzeczywistym TaqMan

Izolacja RNA, odwrotna transkrypcja i macierz miRNA Próbki krwi pobrane do probówek zawierających EDTA i odwirowane przy 4000 x g przez 15 min w celu oddzielenia osocza. Osocze przeniesiono do czystej probówki do mikrowirówki i ponownie odwirowano przy 12 000 x g przez 5 minut, a 200 ul osocza przeniesiono do nowej probówki do mikrowirówki i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy. RNA będzie izolowane przy użyciu zestawu High Pure miRNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie będzie przechowywane w temperaturze -80°C do czasu eksperymentu.

Reakcja odwrotnej transkrypcji W przypadku analiz miRNA metodą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), 100 ng całkowitego RNA zostanie poddane odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Wszystkie reakcje będą przeprowadzane zgodnie z protokołem producenta.

Macierze TaqMan o niskiej gęstości TLDA zostaną przeanalizowane w celu zidentyfikowania profilu różnie wyrażanych miRNA między trzema zestawami próbek (przed leczeniem, 7 dni po leczeniu, jeden miesiąc po leczeniu). W skrócie, całkowity RNA zostanie poddany odwrotnej transkrypcji do cDNA przez zestaw TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit i pulę zestawów Megaplex RT A i B w wersji 3.0 (Applied Biosystems). Produkt RT zostanie załadowany do TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 (Applied Biosystems), umożliwiając jednoczesną ocenę ilościową 667 ludzkich miRNA. Testy i analizy mikroRNA TaqMan zostaną przeprowadzone na aparacie ABI 7900HT (Applied Biosystems). Wszystkie reakcje przeprowadzono zgodnie ze standardowymi protokołami producentów. Ilościowe dane dotyczące ekspresji miRNA uzyskano i znormalizowano przy użyciu oprogramowania ABI 7900HT SDS (Applied Biosystems).

Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) Ekspresja miRNA wykryta za pomocą macierzy o niskiej gęstości TaqMan będzie również badana w guzach HCC i / lub ich sparowanej prawidłowej tkance wątroby za pomocą analizy qRT-PCR, jak opisano wcześniej (Lee i wsp. ., 2011). SnRNA RNU6B zastosowano jako kontrolę endogenną. Każdy test mikroRNA przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Ekspresję mikroRNA podano jako wartość delta Ct (wartość Ct RNU6B - wartość Ct docelowego mikroRNA). Badacze zdefiniowali grupy guzów lub komórek o wysokiej lub niskiej ekspresji na podstawie mediany wartości ekspresji każdego mikroRNA.

Analiza statystyczna Całkowite przeżycie i przeżycie wolne od progresji zostaną ocenione przy użyciu metody Kaplana-Meiera. Po zidentyfikowaniu określonego białka w badaniu proteomicznym pacjenci zostaną podzieleni na grupę o wysokiej ekspresji i grupę o niskiej ekspresji, zgodnie z medianą poziomu ekspresji miRNA w osoczu wszystkich pacjentów; różnica przeżycia między grupą o wysokiej ekspresji a grupą o niskiej ekspresji zostanie przeanalizowana przy użyciu testu log-rank. wartość p mniejsza niż 0,05 będzie uważana za istotną.