肝細胞癌の診断および予後バイオマーカーとしての miRNA

バックグラウンド：

肝細胞癌 (HCC) は、世界で 6 番目に多い癌であり、癌の死亡率は 3 番目です (Kamangar et al., 2006)。 肝細胞癌の治療には、外科的切除、高周波アブレーション (RFA) や経皮エタノール注射 (PEI) などの局所療法、経動脈化学塞栓術 (TACE)、および最善の支持療法が含まれます (Bruix および Sherman、2005)。 外科的介入または局所療法の候補ではない患者には、ソラフェニブが推奨されます（Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008）。 しかし、外科的切除などの治療が成功した後でも、ほとんどの患者は腫瘍の再発または進行に苦しんでいた（Bruix and Sherman、2005; Llovet et al.、2002; Llovet et al.、2008）。 奥田病期分類システム、AJCC システム、BCLC 病期分類システム、CLIP スコアリング システムなど、いくつかの HCC 病期分類システムが開発されていますが、各病期分類システムの予後値は一貫していません (Chen et al., 2009)。そして、各病期分類システムの適用可能性は、選択した治療法によって異なります。

ＨＣＣの転帰を予測する際の臨床病期分類システムには欠点があるため、ＨＣＣの予後を予測するための血清バイオマーカーを検索することは非常に興味深い（Fujiyama et al., 2002; Marrero and Lok, 2004）。 その中でも、アルファフェトプロテイン (AFP) は最もよく研​​究されています。 ＡＦＰは、ＨＣＣを診断する際のマーカーとして（Ｂｒｕｉｘら、２００１年）、また新たに診断されたＨＣＣの予後因子として（１９９８年）使用されている。 AFP は、化学療法反応の予測因子としても価値があります (Chan et al., 2009)。 しかし、腫瘍の外科的切除後または局所治療後の HCC に対する AFP の適用性はまだ不明です。 HCC を患い、血清 AFP レベルが正常である患者の場合、APF を予後因子として使用することはできません。 グリペカン-3 などの他のバイオマーカーはまだ開発中です (Marrero および Lok、2004)。

17～25ヌクレオチドの非コードRNAであるマイクロRNA（miRNA）は、がんにおいて頻繁に調節不全に陥り、がんのスクリーニング、診断、治療効果の監視、および予後予測のための新規の非侵襲性バイオマーカーとして浮上している（Wu et al., 2007）。 miRNA は、内在性 RNase に対する耐性により血清中で安定に発現し、高い安定性で容易に保存されます (Aref et al., 2014)。 いくつかの研究では、肝臓がん、結腸直腸がん、膵臓がんなどの多くのがんにおけるヒト血清miRNAの異常な発現が示されています（Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013）。 HCC の診断バイオマーカーとしての miRNA の感度は、最大 80% である可能性があります (ying et al., 2014)。 miRNA アレイを使用すると、miRNA シグネチャが生成され、腫瘍の診断と予後予測のためのバイオマーカーの感度と特異性がさらに向上します。

トライアルの目的：

1. HCCの診断または予測バイオマーカーとして血清miRNAを同定する。
2. 血清、HCC腫瘍組織、および隣接する非腫瘍組織間のmiRNAの発現レベルと相関するため。
3. HCC の治療に対する反応に影響を与える可能性のある遺伝子/遺伝子変異に関する将来の探索的研究のために、デオキシリボ核酸 (DNA) を収集および保管する。
4. HCCの治療反応に影響を与える可能性のあるタンパク質/遺伝子/遺伝子変異に関する将来の探索的研究のために、余剰の血漿および腫瘍組織を収集および保管する。

方法： 研究デザイン これは前向き研究です。 すべての患者はインフォームドコンセントを提供する必要があります。 国立台湾大学と極東記念病院でHCCと診断された20歳以上の患者計200人が登録される。 HCC の診断基準は、2011 年の AASLD 基準に準拠しています (Bruix et al., 2011)。 簡単に言うと、肝硬変肝臓の超音波スクリーニングで見つかった 1 cm を超える小結節は、CT スキャンまたは造影 MRI のいずれか 1 つの動的検査でさらに調査する必要があります。 ある技術では、外観が HCC に典型的なもの (つまり、門脈相/静脈相のウォッシュアウトを伴う血管過多) である場合、病変は HCC と診断されます。 所見が特徴的でない場合、または血管プロファイルが複数の技術間で一致しない場合は、病変を生検する必要があります。 臨床病期分類では、BCLC 病期分類と臨床 TNM システムを含む 2 つの病期分類システムがこれらの患者に適用されます。 臨床病理学的データは前向きに収集されます。 治療毒性、改訂された RECIST 基準で定義された治療反応、疾患の進行、全生存期間などの臨床転帰が記録されます。

検体および血清の収集 血液サンプルは、治療前、治療の 7 日後、および治療の 1 か月後の 3 つの時点で収集されます。 血液サンプルは採取時に血漿と単核球に分離され、さらに使用するまで-20℃で保存されます。 治療方法としては、手術、TACE、RFA、PEI、またはソラフェニブを含む抗血管新生剤の使用などが挙げられます。

組織採取 HCC 組織 (T) および対応する非腫瘍肝臓組織 (NT) が取得されます。 手術標本は手術直後に冷凍され、-140℃で保管されます。

ウイルスマーカー B 型肝炎表面抗原 (HBsAg) と HCV に対する抗体 (抗 HCV) は、すべての患者について市販の酵素結合免疫吸着アッセイ キットを使用してチェックされます。 HBs抗原陽性患者の場合、HBe抗原および抗HBe抗体は酵素免疫吸着法により測定されます。 HBV DNA の血清レベルは、社内の TaqMan リアルタイム ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって測定されます。 抗 HCV 陽性患者の場合、HCV RNA は社内の TaqMan リアルタイム PCR によって測定されます。

RNA の単離、逆転写、miRNA アレイ 血液サンプルを EDTA の入ったチューブに採取し、4,000x g で 15 分間遠心分離して血漿を分離しました。 血漿を清潔な微量遠心管に移し、12,000×gで5分間再度遠心分離し、200μlの血漿を新しい微量遠心管に移し、分析まで-80℃で保存する。 ＲＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を製造業者の指示に従って使用して単離し、実験まで−８０℃で保存する。

逆転写反応 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) による miRNA 分析の場合、TaqMan miRNA 逆転写キット (Applied Biosystems、カールズバッド、カリフォルニア州、米国) を使用して 100 ng の全 RNA が逆転写されます。 すべての反応は、製造元のプロトコルに指定されているとおりに実行されます。

TaqMan 低密度アレイ TLDA を分析して、3 セットのサンプル (治療前、治療後 7 日間、治療後 1 か月) 間で差次的に発現された miRNA のプロファイルを特定します。 簡単に言うと、総 RNA は、TaqMan MicroRNA 逆転写キットおよび Megaplex RT セット プール A および B バージョン 3.0 (Applied Biosystems) によって cDNA に逆転写されます。 RT 製品は TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 (Applied Biosystems) にロードされ、667 個のヒト miRNA の同時定量が可能になります。 TaqMan microRNA アッセイおよび分析は、ABI 7900HT 機器 (Applied Biosystems) で実行されます。 すべての反応は、標準的な製造業者のプロトコールに従って実行されました。 定量的な miRNA 発現データを取得し、ABI 7900HT SDS ソフトウェア (Applied Biosystems) を使用して正規化しました。

定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) TaqMan 低密度アレイを介して検出された miRNA の発現は、以前に記載されているように、qRT-PCR 分析によって HCC 腫瘍および/またはそれらの対になった正常肝組織でも同様に研究されます (Lee et al .、2011）。 RNU6B snRNA を内在性コントロールとして使用しました。 各マイクロ RNA アッセイは 3 回実行されました。 マイクロRNAの発現はデルタCt値(RNU6BのCt値 - 標的マイクロRNAのCt値)として報告された。 研究者らは、各マイクロRNAの発現中央値に基づいて、発現が高いまたは低い腫瘍または細胞のグループを定義しました。

統計分析 全生存期間および無増悪生存期間は、カプラン マイヤー法を使用して評価されます。 プロテオミクス研究によって特定のタンパク質が同定されると、全患者の miRNA の血漿発現レベルの中央値に従って、患者は高発現グループと低発現グループに分けられます。高発現グループと低発現グループ間の生存差は、ログランク検定を使用して分析されます。 0.05 未満の p 値は有意とみなされます。