MiARN comme biomarqueur diagnostique et pronostique du carcinome hépatocellulaire

Arrière-plan:

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le sixième cancer le plus fréquent et le troisième taux de mortalité par cancer dans le monde (Kamangar et al., 2006). Les traitements du carcinome hépatocellulaire comprennent la résection chirurgicale, les thérapies locales telles que l'ablation par radiofréquence (RFA) et l'injection percutanée d'éthanol (PEI), la chimioembolisation transartérielle (TACE) et les meilleurs soins de soutien (Bruix et Sherman, 2005). Pour les patients qui ne sont pas candidats à une intervention chirurgicale ou à des thérapies locales, le sorafenib est recommandé (Cheng et al., 2009 ; Llovet et al., 2008). Cependant, même après un traitement réussi tel qu'une résection chirurgicale, la plupart des patients souffraient de récidive ou de progression de la tumeur (Bruix et Sherman, 2005 ; Llovet et al., 2002 ; Llovet et al., 2008). Bien que plusieurs systèmes de stadification du HCC aient été développés, tels que le système de stadification Okuda, le système AJCC, le système de stadification BCLC et le système de notation CLIP, la valeur pronostique de chaque système de stadification n'est pas cohérente (Chen et al., 2009), et l'applicabilité de chaque système de mise en scène dépend de la méthodologie de traitement choisie.

En raison de l'insuffisance des systèmes de stadification clinique pour prédire l'issue du CHC, il est très intéressant de rechercher des biomarqueurs sériques pour prédire le pronostic du CHC (Fujiyama et al., 2002 ; Marrero et Lok, 2004). Parmi elles, l'alpha-foetoprotéine (AFP) est la plus étudiée. L'AFP a été utilisée comme marqueur dans le diagnostic du CHC (Bruix et al., 2001) et comme facteur pronostique pour le CHC nouvellement diagnostiqué (1998). L'AFP est également utile en tant que facteur prédictif de la réponse à la chimiothérapie (Chan et al., 2009). Cependant, l'applicabilité de l'AFP pour le CHC après résection chirurgicale de la tumeur ou après un traitement local est encore incertaine. Pour les patients avec un CHC et un taux sérique normal d'AFP, l'APF ne pouvait pas être utilisé comme facteur pronostique. D'autres biomarqueurs, comme le glipécan-3, sont encore en cours de développement (Marrero et Lok, 2004).

Les microARN (miARN), des ARN non codants de 17 à 25 nucléotides, sont fréquemment dérégulés dans le cancer et émergent comme un nouveau biomarqueur non invasif pour le dépistage du cancer, le diagnostic, la surveillance de l'efficacité du traitement et la prédiction du pronostic (Wu et al., 2007). Les miARN s'expriment de manière stable dans le sérum en raison de leur résistance à la RNase endogène et se stockent facilement avec une stabilité élevée (Aref et al., 2014). Plusieurs études ont montré une expression anormale des miARN sériques humains dans de nombreux cancers tels que le cancer du foie, colorectal et pancréatique (Huang et al., 2010 ; Liu et al., 2012 ; Qi et al., 2013). La sensibilité des miARN en tant que biomarqueur diagnostique du CHC pourrait atteindre 80 % (Yin et al., 2014). L'utilisation de réseaux de miARN peut générer des signatures de miARN et améliorer encore la sensibilité et la spécificité du biomarqueur pour le diagnostic des tumeurs et la prédiction du pronostic.

Objectif d'essai：

1. Identifier les miARN sériques comme biomarqueur de diagnostic ou de prédiction du CHC.
2. Pour établir une corrélation avec le niveau d'expression des miARN entre le sérum, le tissu tumoral HCC et le tissu non tumoral adjacent.
3. Recueillir et stocker l'acide désoxyribonucléique (ADN) pour de futures recherches exploratoires sur les gènes/variations génétiques susceptibles d'influencer la réponse au traitement du CHC.
4. Recueillir et stocker les surplus de plasma et de tissus tumoraux pour de futures recherches exploratoires sur les protéines/gènes/variations génétiques susceptibles d'influencer la réponse au traitement dans les CHC.

Méthodes： Conception de l'étude Il s'agit d'une étude prospective. Tous les patients doivent fournir un consentement éclairé. Un total de 200 patients âgés de plus de 20 ans chez lesquels un CHC a été diagnostiqué à l'Université nationale de Taïwan et à l'hôpital Far-Eastern Memorial seront inscrits. Les critères diagnostiques du CHC sont selon les critères AASLD 2011 (Bruix et al., 2011). En bref, les nodules de plus de 1 cm trouvés lors du dépistage échographique d'un foie cirrhotique doivent être étudiés plus avant avec une étude dynamique, soit un scanner ou une IRM de contraste. Si l'aspect est typique du CHC (c'est-à-dire hypervasculaire avec lavage dans la phase portale/veineuse) dans une technique, la lésion serait diagnostiquée comme CHC. Si les résultats ne sont pas caractéristiques ou si le profil vasculaire n'est pas une coïncidence entre les techniques, la lésion doit être biopsiée. Pour la stadification clinique, deux systèmes de stadification seront appliqués à ces patients, y compris la stadification BCLC et le système clinique TNM. Les données clinicopathologiques seront recueillies de manière prospective. Les résultats cliniques, y compris la toxicité du traitement, la réponse au traitement telle que définie par les critères RECIST révisés, la progression de la maladie et la survie globale seront enregistrés.

Prélèvement d'échantillons et de sérum Des échantillons de sang seront prélevés à 3 moments avant le traitement, 7 jours après le traitement et un mois après le traitement. Les échantillons de sang seront séparés en plasma et en cellules mononucléaires lors de la collecte et seront stockés à -20 °C avant toute utilisation ultérieure. Les méthodes de traitement comprennent l'opération, la TACE, la RFA, la PEI ou un agent anti-angiogenèse, y compris l'utilisation de sorafenib.

Prélèvement tissulaire Les tissus HCC (T) et les tissus hépatiques non tumoraux correspondants (NT) seront obtenus. Les échantillons chirurgicaux seront congelés immédiatement après la chirurgie et conservés à -140°C.

Marqueur viral L'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) et les anticorps contre le VHC (anti-VHC) seront vérifiés à l'aide de kits de dosage immunoenzymatique disponibles dans le commerce pour chaque patient. Pour les patients positifs à l'HBsAg, l'HBeAg et l'anti-HBe seront mesurés par dosage immuno-enzymatique. Le taux sérique d'ADN du VHB sera mesuré par la réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel TaqMan. Pour les patients anti-VHC positifs, l'ARN du VHC sera mesuré par PCR en temps réel TaqMan en interne

Isolation d'ARN, transcription inverse et réseau de miARN Échantillons de sang prélevés dans des tubes contenant de l'EDTA et centrifugés à 4 000 x g pendant 15 min pour la séparation du plasma. Le plasma est transféré dans un microtube à centrifuger propre et centrifugé à nouveau à 12 000 x g pendant 5 min. 200 ul de plasma seront transférés dans un nouveau microtube à centrifuger et stockés à -80 °C jusqu'à l'analyse. L'ARN sera isolé à l'aide du kit d'isolement High Pure miRNA (Roche, Mannheim, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant, puis stocké à -80 _C jusqu'à l'expérience.

Réaction de transcription inverse Pour les analyses de miARN par réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR), 100 ng d'ARN total seront transcrits en utilisant le kit TaqMan miRNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Toutes les réactions seront effectuées comme spécifié dans le protocole du fabricant.

Les puces à faible densité TaqMan TLDA seront analysées pour identifier le profil des miARN exprimés de manière différentielle entre les trois séries d'échantillons (pré-traitement, 7 jours après le traitement, un mois après le traitement). En bref, l'ARN total sera rétrotranscrit en ADNc par le kit de transcription inverse TaqMan MicroRNA et le pool A et B de Megaplex RT version 3.0 (Applied Biosystems). Le produit RT sera chargé dans l'ensemble de cartes TaqMan Array Human MicroRNA A+B v3.0 (Applied Biosystems), permettant la quantification simultanée de 667 miARN humains. Les dosages et analyses de microARN TaqMan seront effectués sur l'instrument ABI 7900HT (Applied Biosystems). Toutes les réactions ont été réalisées selon les protocoles standards des fabricants. Les données quantitatives d'expression des miARN ont été acquises et normalisées à l'aide du logiciel ABI 7900HT SDS (Applied Biosystems).

PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) L'expression des miARN détectés via les puces à faible densité TaqMan sera également étudiée dans les tumeurs HCC et / ou leur tissu hépatique normal apparié par analyse qRT-PCR comme décrit précédemment (Lee et al ., 2011). Le snRNA RNU6B a été utilisé comme contrôle endogène. Chaque dosage de microARN a été réalisé en triple exemplaire. L'expression des microARN a été rapportée sous forme de valeur delta Ct (valeur Ct de RNU6B - valeur Ct du microARN cible). Les chercheurs ont défini les groupes de tumeurs ou de cellules à expression élevée ou faible en fonction de la valeur d'expression médiane de chaque microARN.

Analyse statistique La survie globale et la survie sans progression seront évaluées selon la méthode de Kaplan-Meier. Une fois qu'une protéine spécifique est identifiée par l'étude protéomique, les patients seront divisés en groupe à haute expression et groupe à faible expression, selon le niveau d'expression plasmatique médian du miARN de tous les patients ; la différence de survie entre le groupe à haute expression et le groupe à faible expression sera analysée à l'aide du test du log-rank. Une valeur de p inférieure à 0,05 sera considérée comme significative.