A MiRNS mint a hepatocelluláris karcinóma diagnosztikai és prognosztikai biomarkere

Háttér:

A hepatocelluláris karcinóma (HCC) a hatodik leggyakoribb rák és a rák halálozási aránya a harmadik helyen áll a világon (Kamangar et al., 2006). A hepatocelluláris karcinóma kezelése magában foglalja a sebészeti reszekciót, a helyi terápiákat, például a rádiófrekvenciás ablációt (RFA) és a perkután etanol injekciót (PEI), a transzarteriális kemoembolizációt (TACE) és a legjobb szupportív ellátást (Bruix és Sherman, 2005). Azon betegek számára, akik nem esnek sebészeti beavatkozásra vagy helyi terápiára, a sorafenib javasolt (Cheng és mtsai, 2009; Llovet és mtsai, 2008). Azonban még a sikeres kezelés, például a műtéti reszekció után is a legtöbb beteg a daganat kiújulását vagy progresszióját tapasztalta (Bruix és Sherman, 2005; Llovet és mtsai, 2002; Llovet és mtsai, 2008). Bár a HCC-nek számos állomásozó rendszert fejlesztettek ki, mint például az Okuda szakaszoló rendszer, az AJCC rendszer, a BCLC szakaszolási rendszer és a CLIP pontozási rendszer, az egyes szakaszoló rendszerek prognosztikai értéke nem konzisztens (Chen et al., 2009). és az egyes szakaszolórendszerek alkalmazhatósága a kiválasztott kezelési módszertől függ.

A HCC kimenetelének előrejelzésében a klinikai staging rendszerek hiányosságai miatt nagy érdeklődésre tart számot a szérum biomarkerek keresése a HCC prognózisának előrejelzéséhez (Fujiyama et al., 2002; Marrero és Lok, 2004). Közülük az alfa-fetoprotein (AFP) a leginkább tanulmányozott. Az AFP-t markerként használták a HCC diagnosztizálásában (Bruix és mtsai, 2001), valamint az újonnan diagnosztizált HCC prognosztikai faktoraként (1998). Az AFP a kemoterápiás válasz prediktív tényezőjeként is értékes (Chan et al., 2009). Az AFP HCC-re való alkalmazhatósága azonban a daganat sebészi eltávolítása vagy helyi terápia után még mindig bizonytalan. HCC-s és normál szérumszintű AFP-s betegeknél az APF nem használható prognosztikai tényezőként. Más biomarkerek, mint például a glipecan-3, még fejlesztés alatt állnak (Marrero és Lok, 2004).

A mikroRNS-ek (miRNS-ek), 17-25 nukleotidból álló, nem kódoló RNS-ek, gyakran szabályozatlanok a rák esetében, és új, nem invazív biomarkerekké válnak a rákszűréshez, diagnózishoz, a terápia hatékonyságának monitorozásához és a prognózis előrejelzéséhez (Wu et al., 2007). A MiRNS-ek stabilan expresszálódnak a szérumban, mivel rezisztensek az endogén RNázzal szemben, és könnyen, nagy stabilitással tárolhatók (Aref et al., 2014). Számos tanulmány kimutatta a humán szérum miRNS-ek abnormális expresszióját számos rákban, például máj-, vastagbél- és hasnyálmirigyrákban (Huang és mtsai, 2010; Liu és mtsai, 2012; Qi és mtsai, 2013). A miRNS, mint a HCC diagnosztikai biomarkere érzékenysége akár 80% is lehet (Yin et al., 2014). A miRNS tömbök használatával miRNS aláírások generálhatók, és tovább javítható a biomarker érzékenysége és specificitása a tumor diagnózisához és a prognózis előrejelzéséhez.

Próba célja:

1. A szérum miRNS azonosítása HCC diagnózis vagy predikciós biomarkereként.
2. Korrelálni a miRNS expressziós szintjével a szérum, a HCC tumorszövet és a szomszédos nem daganatos szövet között.
3. A dezoxiribonukleinsav (DNS) összegyűjtése és tárolása olyan gének/genetikai variáció jövőbeli feltáró kutatása céljából, amelyek befolyásolhatják a HCC kezelésre adott választ.
4. Felesleges plazma- és tumorszövetek összegyűjtése és tárolása olyan fehérjék/gének/genetikai variációk jövőbeli felderítő kutatása céljából, amelyek befolyásolhatják a kezelésre adott választ HCC-kben.

Módszerek: A vizsgálat tervezése Ez egy prospektív vizsgálat. Minden betegnek tájékoztatáson alapuló beleegyezését kell adnia. Összesen 200 20 év feletti beteget vesznek fel, akiknél HCC-t diagnosztizáltak a Tajvani Nemzeti Egyetemen és a Távol-Kelet Memorial Kórházban. A HCC diagnosztikai kritériumai a 2011-es AASLD kritériumok szerint vannak (Bruix et al., 2011). Röviden, a cirrhoticus máj ultrahangos szűrése során talált 1 cm-nél nagyobb csomókat tovább kell vizsgálni egy dinamikus vizsgálattal, akár CT-vizsgálattal, akár kontrasztos MRI-vel. Ha a megjelenése a HCC-re jellemző (azaz hipervaszkuláris kimosódással a portális/vénás fázisban) az egyik technikában, a léziót HCC-ként diagnosztizálják. Ha a leletek nem jellemzőek, vagy az érprofil nem egybeesik a technikák között, a lézióból biopsziát kell venni. A klinikai stádium meghatározásához két staging rendszert alkalmaznak ezeknél a betegeknél, beleértve a BCLC staging rendszert és a klinikai TNM rendszert. A klinikopatológiai adatokat prospektíven gyűjtik. Fel kell jegyezni a klinikai eredményeket, beleértve a kezelés toxicitását, a kezelésre adott választ a felülvizsgált RECIST kritériumok szerint, a betegség progresszióját és a teljes túlélést.

Minta- és szérumgyűjtés A vérmintákat a kezelés előtt három időpontban, a kezelés után 7 nappal és a kezelés után egy hónappal kell gyűjteni. A vérmintákat plazma- és mononukleáris sejtekben különítik el a gyűjtés után, és -20°-on tárolják a további felhasználás előtt. A kezelési módszerek közé tartozik a műtét, a TACE, az RFA, a PEI vagy az angiogenezis elleni szer, beleértve a szorafenib alkalmazását.

Szövetgyűjtés A HCC szöveteket (T) és a megfelelő nem tumoros májszöveteket (NT) nyerjük. A műtéti mintákat közvetlenül a műtét után lefagyasztják és -140°C-on tárolják.

A vírusmarker Hepatitis B felszíni antigén (HBsAg) és a HCV elleni antitest (anti-HCV) ellenőrzése a kereskedelemben kapható, enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati készletekkel történik minden betegnél. HBsAg-pozitív betegeknél a HBeAg-t és az anti-HBe-t enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal mérik. A HBV DNS szérumszintjét a házon belüli TaqMan valós idejű polimeráz láncreakcióval (PCR) mérik. Az anti-HCV pozitív betegeknél a HCV RNS-t a házon belüli TaqMan valós idejű PCR-rel mérik.

RNS izolálás, reverz transzkripció és miRNS array Vérmintákat vettünk EDTA-t tartalmazó csövekbe, és 4000 x g-vel centrifugáltuk 15 percig a plazma elválasztáshoz. A tiszta mikrocentrifugacsőbe átvitt plazmát 12 000 x g-vel 5 percig ismét centrifugáltuk, majd 200 ul plazmát áthelyeznek egy új mikrocentrifugacsőbe, és -80 °C-on tárolják az elemzésig. Az RNS-t High Pure miRNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Németország) segítségével izoláljuk a gyártó utasításai szerint, majd a kísérletig -80 °C-on tároljuk.

Reverz transzkripciós reakció A miRNS kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióval (qRT-PCR) történő elemzéséhez 100 ng teljes RNS-t írnak le reverz transzkripcióval a TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) segítségével. Minden reakciót a gyártó protokolljában meghatározottak szerint hajtanak végre.

TaqMan alacsony sűrűségű tömbök A TLDA-t elemezni fogják, hogy azonosítsák a differenciáltan expresszált miRNS-ek profilját a három mintakészlet között (előkezelés, 7 nappal a kezelés után, egy hónappal a kezelés után). Röviden, a teljes RNS-t a TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit és a Megaplex RT készlet A és B készlet 3.0 verziója (Applied Biosystems) cDNS-vé írja át. Az RT termék a TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0-ba (Applied Biosystems) kerül betöltésre, lehetővé téve 667 humán miRNS egyidejű mennyiségi meghatározását. A TaqMan mikroRNS vizsgálatokat és elemzéseket az ABI 7900HT Instrument (Applied Biosystems) készüléken hajtják végre. Minden reakciót a gyártó szabványos protokollja szerint végeztünk. A kvantitatív miRNS expressziós adatokat ABI 7900HT SDS szoftverrel (Applied Biosystems) gyűjtöttük és normalizáltuk.

Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) A TaqMan kis sűrűségű tömbökön keresztül kimutatott miRNS expresszióját szintén tanulmányozni fogják a HCC daganatokban és/vagy azok párosított normál májszövetében qRT-PCR analízissel a korábban leírtak szerint (Lee et al. ., 2011). Az RNU6B snRNS-t endogén kontrollként alkalmaztuk. Mindegyik mikroRNS-vizsgálatot három párhuzamosban végeztük el. A mikroRNS-ek expresszióját delta Ct értékként (RNU6B Ct értéke - cél mikroRNS Ct értéke) jelentették. A kutatók az egyes mikroRNS-ek medián expressziós értéke alapján határozták meg a magas vagy alacsony expressziójú daganatok vagy sejtek csoportjait.

Statisztikai elemzés A teljes túlélést és a progressziómentes túlélést Kaplan-Meier módszerével értékeljük. Miután a proteomikai vizsgálat azonosított egy specifikus fehérjét, a betegeket magas expressziós csoportokra és alacsony expressziós csoportokra osztják, az összes beteg miRNS-ének medián plazmaexpressziós szintjének megfelelően; A magas expressziós csoport és az alacsony expressziós csoport közötti túlélési különbséget log-rank teszttel elemezzük. a 0,05-nél kisebb p-érték szignifikánsnak minősül.