MiRNA come biomarcatore diagnostico e prognostico del carcinoma epatocellulare

Sfondo:

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il sesto tumore più comune e il terzo tasso di mortalità per cancro nel mondo (Kamangar et al., 2006). I trattamenti del carcinoma epatocellulare comprendono la resezione chirurgica, le terapie locali come l'ablazione con radiofrequenza (RFA) e l'iniezione percutanea di etanolo (PEI), la chemioembolizzazione transarteriosa (TACE) e la migliore terapia di supporto (Bruix e Sherman, 2005). Per i pazienti che non sono candidati all'intervento chirurgico o alle terapie locali, si raccomanda il sorafenib (Cheng et al., 2009; Llovet et al., 2008). Tuttavia, anche dopo un trattamento di successo come la resezione chirurgica, la maggior parte dei pazienti soffriva di recidiva o progressione del tumore (Bruix e Sherman, 2005; Llovet et al., 2002; Llovet et al., 2008). Sebbene siano stati sviluppati diversi sistemi di stadiazione dell'HCC, come il sistema di stadiazione Okuda, il sistema AJCC, il sistema di stadiazione BCLC e il sistema di punteggio CLIP, il valore prognostico di ciascun sistema di stadiazione non è coerente (Chen et al., 2009), e l'applicabilità di ciascun sistema di stadiazione dipende dalla metodologia di trattamento selezionata.

A causa della carenza dei sistemi di stadiazione clinica nel predire l'esito dell'HCC, è di grande interesse ricercare biomarcatori sierici per predire la prognosi dell'HCC (Fujiyama et al., 2002; Marrero e Lok, 2004). Tra questi, l'alfa-fetoproteina (AFP) è il più ben studiato. L'AFP è stato utilizzato come marker nella diagnosi di HCC (Bruix et al., 2001) e come fattore prognostico per HCC di nuova diagnosi (1998). L'AFP è anche utile come fattore predittivo per la risposta alla chemioterapia (Chan et al., 2009). Tuttavia, l'applicabilità dell'AFP per HCC dopo resezione chirurgica del tumore o dopo terapia locale è ancora incerta. Per i pazienti con HCC e livelli sierici normali di AFP, l'APF non può essere utilizzato come fattore prognostico. Altri biomarcatori, come il glipecan-3, sono ancora in fase di sviluppo (Marrero e Lok, 2004).

I microRNA (miRNA), RNA non codificanti da 17 a 25 nucleotidi, sono spesso disregolati nel cancro e stanno emergendo come nuovi biomarcatori non invasivi per lo screening del cancro, la diagnosi, il monitoraggio dell'efficacia della terapia e la previsione della prognosi (Wu et al., 2007). I miRNA sono stabilmente espressi nel siero grazie alla loro resistenza all'RNasi endogena e alla loro facile conservazione con elevata stabilità (Aref et al., 2014). Diversi studi hanno mostrato un'espressione anormale di miRNA sierici umani in molti tumori come il cancro del fegato, del colon-retto e del pancreas (Huang et al., 2010; Liu et al., 2012; Qi et al., 2013). La sensibilità del miRNA come biomarcatore diagnostico di HCC potrebbe arrivare fino all'80% (Yin et al., 2014). L'utilizzo di array di miRNA può generare firme di miRNA e migliorare ulteriormente la sensibilità e la specificità del biomarcatore per la diagnosi del tumore e la previsione della prognosi.

Scopo della prova:

1. Identificare il miRNA sierico come biomarcatore diagnostico o predittivo per l'HCC.
2. Per correlare con il livello di espressione di miRNA tra siero, tessuto tumorale HCC e tessuto non tumorale adiacente.
3. Raccogliere e conservare l'acido desossiribonucleico (DNA) per future ricerche esplorative sui geni/variazioni genetiche che possono influenzare la risposta al trattamento nell'HCC.
4. Raccogliere e conservare il plasma in eccesso e i tessuti tumorali per future ricerche esplorative su proteine/geni/variazioni genetiche che possono influenzare la risposta al trattamento negli HCC.

Metodi： Disegno dello studio Questo è uno studio prospettico. Tutti i pazienti devono fornire consensi informati. Saranno arruolati un totale di 200 pazienti di età superiore ai 20 anni a cui viene diagnosticato l'HCC presso la National Taiwan University e il Far-Eastern Memorial Hospital. I criteri diagnostici di HCC sono conformi ai criteri AASLD del 2011 (Bruix et al., 2011). In breve, i noduli più di 1 cm trovati sullo screening ecografico di un fegato cirrotico dovrebbero essere ulteriormente studiati con uno studio dinamico, o TAC o risonanza magnetica con mezzo di contrasto. Se l'aspetto è tipico dell'HCC (cioè ipervascolare con washout nella fase portale/venosa) in una tecnica, la lesione verrebbe diagnosticata come HCC. Se i reperti non sono caratteristici o il profilo vascolare non è coincidente tra le tecniche, la lesione deve essere sottoposta a biopsia. Per la stadiazione clinica, a questi pazienti verranno applicati due sistemi di stadiazione, tra cui la stadiazione BCLC e il sistema clinico TNM. I dati clinicopatologici saranno raccolti in modo prospettico. Verranno registrati gli esiti clinici, inclusa la tossicità del trattamento, la risposta al trattamento come definita dai criteri RECIST rivisti, la progressione della malattia e la sopravvivenza globale.

Raccolta di campioni e siero I campioni di sangue verranno raccolti in 3 punti temporali prima del trattamento, 7 giorni dopo il trattamento e un mese dopo il trattamento. I campioni di sangue saranno separati in plasma e cellule mononucleate al momento della raccolta e saranno conservati in -20Ç prima di un ulteriore utilizzo. I metodi di trattamento includono operazione, TACE, RFA, PEI o agente anti-angiogenesi compreso l'uso di sorafenib.

Prelievo dei tessuti Verranno prelevati i tessuti HCC (T) ei corrispondenti tessuti epatici non tumorali (NT). I campioni chirurgici saranno congelati immediatamente dopo l'intervento chirurgico e conservati a -140°C.

Il marcatore virale dell'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) e l'anticorpo anti-HCV (anti-HCV) saranno controllati utilizzando kit di analisi immunoassorbenti legati all'enzima disponibili in commercio per ogni paziente. Per i pazienti HBsAg positivi, l'HBeAg e l'anti-HBe saranno misurati mediante test di immunoassorbimento enzimatico. Il livello sierico di HBV DNA sarà misurato mediante reazione a catena della polimerasi in tempo reale TaqMan (PCR) interna. Per i pazienti anti-HCV positivi, l'RNA dell'HCV sarà misurato mediante PCR in tempo reale interna TaqMan

Isolamento dell'RNA, trascrizione inversa e array di miRNA Campioni di sangue prelevati in provette contenenti EDTA e centrifugati a 4.000 x g per 15 minuti per la separazione del plasma. Il plasma trasferito in una provetta da microcentrifuga pulita e centrifugato nuovamente a 12.000 x g per 5 minuti e 200 ul di plasma saranno trasferiti in una nuova provetta da microcentrifuga e conservati a -80 _C fino all'analisi. L'RNA sarà isolato usando High Pure miRNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Germania) secondo le istruzioni del produttore e poi conservato a -80 _C fino all'esperimento.

Reazione di trascrizione inversa Per le analisi di miRNA mediante reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR), 100 ng di RNA totale saranno trascritti inversamente utilizzando il TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Tutte le reazioni saranno eseguite come specificato nel protocollo del produttore.

Gli array TaqMan a bassa densità TLDA saranno analizzati per identificare il profilo dei miRNA differenzialmente espressi tra i tre set di campioni (pre-trattamento, 7 giorni dopo il trattamento, un mese dopo il trattamento). In breve, l'RNA totale verrà retrotrascritto in cDNA dal TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit e Megaplex RT set pool A e B versione 3.0 (Applied Biosystems). Il prodotto RT verrà caricato in TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 (Applied Biosystems), consentendo la quantificazione simultanea di 667 miRNA umani. I saggi e l'analisi del microRNA TaqMan saranno eseguiti sullo strumento ABI 7900HT (Applied Biosystems). Tutte le reazioni sono state eseguite secondo i protocolli dei produttori standard. I dati quantitativi di espressione del miRNA sono stati acquisiti e normalizzati utilizzando il software ABI 7900HT SDS (Applied Biosystems).

PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) L'espressione di miRNA rilevata tramite array TaqMan a bassa densità sarà studiata anche nei tumori HCC e / o nel loro tessuto epatico normale accoppiato mediante analisi qRT-PCR come descritto in precedenza (Lee et al. ., 2011). Lo snRNA RNU6B è stato utilizzato come controllo endogeno. Ogni analisi del microRNA è stata eseguita in triplice copia. L'espressione di microRNA è stata riportata come valore delta Ct (valore Ct di RNU6B - valore Ct del microRNA target). I ricercatori hanno definito i gruppi di tumori o cellule con espressione alta o bassa in base al valore di espressione mediano di ciascun microRNA.

Analisi statistica La sopravvivenza globale e la sopravvivenza libera da progressione saranno valutate utilizzando il metodo di Kaplan-Meier. Una volta identificata una proteina specifica mediante lo studio proteomico, i pazienti saranno divisi in gruppo ad alta espressione e gruppo a bassa espressione, in base al livello di espressione plasmatica mediano del miRNA di tutti i pazienti; la differenza di sopravvivenza tra il gruppo ad alta espressione e il gruppo a bassa espressione sarà analizzata utilizzando il log-rank test. un valore p inferiore a 0,05 sarà considerato significativo.