신경외과 후 환자의 감염 병소 검출을 위한 신속 검사.

간세포 성장 인자(HGF)는 만성 염증 동안 생물학적으로 비활성화되고 세포외 매트릭스에서 글리코사미노글리칸에 대한 결합 친화력을 잃는 재생 특성을 갖는 국소 급성기 단백질입니다. HGF는 위장관으로 배설되며 정상적인 소변에서는 검출되지 않습니다. 감염으로 인해 뇌 수술 절차가 복잡해지면 병원내 수막염이 발생할 수 있습니다. 근본적인 CNS 질병 과정 및 제자리 CNS 장치로 인해, 병원내 세균성 수막염의 주요 약제는 지역사회 획득 수막염의 약제와 다릅니다. 예를 들어, 병원내 감염에서는 느리게 성장하는 기회 미생물이 우세합니다. 뇌척수액 백혈구 프로필은 뇌내출혈의 영향을 받고 뇌척수액 젖산은 허혈로 인해 상승할 수 있습니다. 더욱이 의식 변화로 인해 신경외과 수술 후 열이 나는 인공호흡기 환자의 진단을 내리기가 어려울 수 있습니다. 즉, 손상된 뇌가 환경 세균총에 의해 침범되었는지 여부를 판단하기 어려운 경우가 많습니다.

진단을 확립하는 데 어려움이 있고 표준이 부족하기 때문에 의사는 심각한 질병에서 의심되는 감염을 광범위한 항생제로 치료하도록 동기를 부여받습니다. 다제내성균의 새로운 문제, 높은 비용, 새로운 항생제와 관련된 합병증으로 인해 항생제 소비를 최소화할 수 있는 진단 테스트가 필요해졌습니다.

현재 세균성 수막염의 진단은 직접 현미경 검사, 백혈구, 젖산염 및 단백질의 감별 분석, 혈액 및 CSF 배양의 표준 방법을 기반으로 합니다. 그러나 신경외과 후 감염은 신경외과 시술의 효과와 구별하기 어렵습니다. 더욱이, 예방 치료로 인해 많은 환자 집단에서 배양 결과가 음성이며 Coagulase 음성 Staphylococcus 또는 Propionbacterium acnes와 같은 피부 세균총의 존재는 감염 또는 오염을 나타낼 수 있습니다. 이 생명을 위협하는 상태로부터의 생존은 신속한 진단과 가능한 병원체를 덮도록 고안된 즉각적인 경험적 항생제 요법에 달려 있습니다.

감염의 초점은 어디입니까? 세균성(패혈성) 뇌수막염인가요? 광범위 항생제 투여가 필요합니까? 프로젝트의 배경: 박테리아가 중추 신경계(CNS)로 침입한 후 지주막 공간, 연질막 및 뇌척수액(CSF)에 영향을 미치는 염증 과정이 빠르게 진행됩니다. 이 상태는 두통, 발열 및 수막증의 임상 증상을 유발합니다. 염증 반응은 수막 세포에서 지주막하 공간으로의 다양한 전염증성 사이토카인의 방출로 인해 발생합니다. 결과적으로 호중구는 지주막하 공간으로 이동하여 CSF에서 백혈구증을 유발합니다. 그 결과 혈액 뇌 장벽의 파괴, 뇌 부종, 뇌 혈류 감소, 저관류의 초점 영역, 혈관 혈전증, 허혈, 혐기성 분해 경로를 통한 포도당 대사 강화, 뇌와 CSF에서의 젖산 축적 증가가 포함됩니다. 1]. 이 생명을 위협하는 상태로부터의 생존은 신속한 진단과 가능한 병원체를 덮도록 고안된 즉각적인 경험적 항생제 요법에 달려 있습니다.

열성 뇌수막염의 다른 원인으로는 급성 바이러스성 뇌수막염과 비화농성 뇌수막염이 있으며 임상 양상은 일반적으로 아급성 또는 만성입니다. 진단 절차는 뇌척수액에서 세포와 박테리아를 분석하기 위한 요추 천자, 혈액과 뇌척수액의 미생물 배양, PCR 및 항원 검출을 포함하는 혈청학적 검사, 방사선 촬영 기술로 구성됩니다[2]. 지역사회획득 뇌수막염에서 CSF 분석의 식별 값의 조합은 매우 높은 민감도로 급성 세균성 뇌수막염을 다른 비보행성 원인과 구별할 수 있습니다[3].

병원성 뇌수막염은 감염에 의해 뇌 수술 절차가 복잡해질 때 발생할 수 있습니다[2]. 근본적인 CNS 질병 과정 및 제자리 CNS 장치로 인해, 병원내 세균성 수막염의 주요 약제는 지역사회 획득 수막염의 약제와 다릅니다. CSF 백혈구 프로파일은 뇌내출혈의 영향을 받고 허혈로 인해 CSF 젖산이 상승할 수 있습니다. 더욱이 의식 변화로 인해 신경외과 수술 후 열이 나는 인공호흡기 환자의 진단을 내리기가 어려울 수 있습니다.

간세포 성장 인자(HGF)는 장기 손상 동안 중간엽 세포에 의해 생성됩니다. 단일 사슬 전구체 단백질로 생산되며 단백질 분해 절단에 의해 손상 부위에서 활성화되어 이중 사슬 활성 형태의 HGF가 생성됩니다[4]. 활성 HGF는 세포 분열[4]과 세포 운동성을 자극하고 손상된 부위에 인접한 상피 세포에서 정상적인 형태 형성 구조[5]를 촉진합니다. 따라서 HGF는 손상된 조직의 재생 및 복구를 유도합니다[6]. 감염으로 인한 손상 동안 높은 수준의 전신 HGF가 검출되었습니다[7]. 세균성 수막염, 폐렴, 급성 세균성 위장염에서는 감염 부위에서 국소적으로 HGF가 생성된다[7-9]. 박테리아 감염 동안 국소적으로 생성된 HGF는 생물학적으로 활성입니다[10]. 파일럿 연구에서 생물학적 활성 HGF의 적용은 만성 다리 궤양의 치유를 촉진했습니다[11]. 효과적인 항생제 치료는 감염 동안 전신 HGF 수준을 감소시킵니다[12-13]. HGF는 치유 특성을 가진 국소 급성기 단백질로 간주될 수 있습니다[14].

수용체에 결합하는 내인성 HGF의 품질은 여러 리간드에 대한 단백질의 친화성을 결정할 수 있는 임상 연구에 적합한 광학 기술인 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 평가할 수 있습니다[15]. 수용체 c-Met 및 HSPG(heparan sulphate proteoglycan)에 대한 HGF 결합 친화도의 SPR 기반 평가는 다양한 생물학적 활성을 갖는 HGF 변이체를 신속하고 민감하게 구별할 수 있습니다[16-17].

우리는 이전에 지역 사회 획득 수막염 환자의 CSF에서 HGF 농도를 연구했습니다 [7]. 우리는 또한 부상 부위에 생물학적으로 활성인 HGF의 존재가 급성 국소 염증을 나타낸다는 것을 보여주었습니다[18]. 최근 연구에서 우리는 HGF 농도와 수용체에 대한 HGF 결합 친화력이 신경외과와 관련된 수막염과 다른 감염 원인을 구별하는 마커 역할을 할 수 있는지 여부를 평가했습니다. 우리는 지역사회 획득 수막염 또는 신경외과 관련 수막염 환자에서 HGF의 농도 및 결합 친화성을 결정하고 그 결과를 알츠하이머병 환자 또는 정상 CSF를 가진 대조군과 비교했습니다. 우리는 CSF에서 HGF의 결정이 질병의 초기 단계에서 CSF로 세균 침입을 진단하기 위한 임상 상태 및 일상적인 실험실 결과를 보완하는 지표로 사용될 수 있음을 보여주었습니다[18].

문제:

증례 보고: 고혈압을 앓고 있는 76세 여성이 2009년 10월 28일 그녀의 정원에서 의식을 잃은 채 이웃에게 발견되었습니다. CT 스캔에서 지주막하출혈이 확인되었고 신경혈관조영술에서 3개의 동맥류가 확인되었습니다. 그녀는 신경외과에 입원하여 10월 29일 동맥류의 심실 배액 및 혈관내 폐쇄로 수술을 받았습니다. 그녀는 수술 후 발관되었지만 왼쪽 팔과 다리 마비와 피로를 겪었습니다. 10월 30일부터 그녀는 미열이 있었고 CRP와 프로칼시토닌이 약간 증가했습니다. 뇌척수액은 적혈구 17만개, 백혈구 630개, 젖산 5.8개를 보였다. 흉부 엑스레이에서 침윤이 의심되는 것으로 나타났습니다. 혈액 및 CSF 배양이 확보되었습니다. 11월 5일부터 채취한 배양에서 소변에서 Enterobacter cloacae와 Staphylococcus aurous의 상당한 성장과 비인두에서 Staphylococcus aurous의 성장이 나타났습니다. 그녀는 항생제 치료를 받지 않았고 매개변수는 자발적으로 감소했지만 미열은 계속되었습니다. CSF 혈액 세포는 23000개의 적혈구와 106개의 백혈구로 증가했으며(11월 11일) CSF 젖산은 4.5(요추 배액)였습니다. CRP는 정상 범위였지만 세균성 수막염이 의심되어 meropenen 2g x 3을 투여받았다. 11월 19일에 먼저 11월 11일에 채취한 CSF 배양에서 프로피오니박테리움 아크네스의 성장이 밝혀졌습니다. 항생제 처방은 11월 23일까지 계속되었다. 그녀는 방향감각 상실, 피로, 수두증을 앓고 있었습니다. 그녀는 11월 23일 션트 수술을 받았습니다. 그녀는 2009년 12월 2일에 사망했습니다. HGF의 고농도 및 HSPG에 대한 상승된 결합 친화도는 이미 11월 2일 CSF 분석에서 발견되었습니다.

진단을 확립하는 데 어려움이 있고 표준이 부족하기 때문에 의사는 감염을 적시에 식별할 수 있는 진단 방법이 없기 때문에 의심되는 감염을 개별적으로 치료하려는 동기가 있습니다. CSF에서 세균 패널 및 바이러스 검출을 위한 PCR은 민감한 방법입니다. 그러나 집락화된 박테리아도 감지할 수 있습니다. 박테리아의 존재는 감염과 동일하지 않습니다. 따라서 특히 뇌 수술 후 세균성 수막염의 경우와 뇌에 삽입된 이물질의 경우 우리는 양성 또는 음성 배양에 전적으로 의존할 수 없습니다. 음성 예측도가 높은 보완 방법(검사실에서 사용 가능한 표준 방법)은 검사의 특이성을 높이고 병원 획득 감염(HAI)과 같은 비용, 시간 및 합병증을 크게 줄입니다.

방법, 역메타크로매시:

HGF(Hairpin Loop)의 N-말단은 c-Met 및 HSPG 모두에 대한 결합 부위로 확인되었습니다. SPR 시스템에서 HSPG와 dextran sulphate에 대한 HGF의 결합 사이에는 높은 상관관계가 있습니다(그림 1). Metochromasia는 특정 aniline 염료가 chromo trope 물질에 결합될 때 나타나는 특징적인 색상 변화입니다[19]. 이 현상은 조직 섹션 연구에서 널리 사용되었습니다. 메틸렌 블루(O-톨루이딘)는 우수한 이색성 염료로 간주됩니다. dextran sulphate와 같은 고분자량 다당류에 결합하면 지시약 용액의 색이 파란색에서 빨간색으로 변합니다[19].

다양한 비율의 덱스트란 설페이트와 O-톨루이딘의 조합은 다양한 강도의 적자색 용액을 생성합니다. 코팅된 맞춤형 여과지는 스트립에 배치되는 표면을 구성합니다. 생물학적 용액과 접촉할 때 샘플 HGF는 경쟁적으로 O-toluidine을 대체하여 dextran sulphate에 결합하고 표면 색상이 파란색으로 돌아갑니다(그림 2). 이 플랫폼은 감염 시 거담제, 소변, 궤양 분비물, 뇌척수액 및 관절 삼출물을 포함한 체액에서 HGF와 같은 HSPG 결합 단백질의 존재를 감지합니다. 다량의 단백질 또는 높은 pH는 이 장치에서 비특이적 반응을 일으키지 않습니다.

학습 계획:

스터디 리더: 아미르 라메자니

절차:

CSF 표본, 소변 및 가래(n=500)는 뇌종양 수술, 뇌내 출혈, 션트 기능 장애 또는 두개골 골절을 겪은 환자(1-99세)로부터 수집됩니다. 시료는 분석이 수행될 때까지 -20°C에서 냉동 보관됩니다. 제외 기준은 없습니다.

알츠하이머병 조절(n=20)

• CSF 샘플은 Malmö에 있는 Skåne University Hospital의 Memory Clinic에서 알츠하이머병 진단을 받은 환자(N=20)로부터 수집하여 냉동 보관했습니다. 수정된 DSM-III 및 NINDS-ADRDA 기준은 알츠하이머 치매의 진단에 사용되었습니다(이 연구 그룹은 이전 연구에 포함됨).
• 정상 뇌척수액
• 이 그룹은 수막염을 배제하기 위해 요추 천자를 받은 환자로 구성되며 정상적인 뇌척수액을 보였습니다.
• 표면 플라즈몬 공명에 의한 리간드 결합 친화도 분석
• HGF의 생물학적 활성은 SPR로 분석됩니다. 이전에 설명한대로 HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 c-Met 재조합 키메라 (R & D Systems)에 대한 결합 친화력을 측정합니다.
• 샘플 내 HGF 농도 측정 CSF 내 HGF 농도를 측정하기 위해 특정 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트(Quantikine Human HGF immunoassay, 최소 검출 한계: 0.04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용했습니다. 제조업체의 지침에 따라 가래 및 소변. 모든 측정은 450 nm에서 ELISA 판독기(Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Austria)로 수행되었으며, 키트에 제공된 재조합 인간 HGF 참조 샘플 및 표준으로 보정되었습니다.
• 역메타크로마시 연구 스트립 테스트는 모든 표본에서 수행됩니다.
• 일상적인 실험실 평가
• CSF는 린셰핑에 있는 대학병원 임상화학과에서 매개변수 값을 결정하기 위해 분석됩니다. 모든 배양, PCR 분석, 항원 검출 분석 및 혈청학적 평가는 스웨덴 Linköping에 있는 University Hospital의 미생물학과에서 수행됩니다.
• CSF-세포: 적혈구 및 백혈구(다형핵 호중구 및 단핵구)의 수를 계산하기 위해 Jessen Chamber를 사용하여 수동 위상차 현미경(Zeiss)으로 수행합니다.
• CSF 락테이트: 벤치탑 혈액 가스 분석기 ABL 800(Radiometer Medical ApS Denmark)을 사용하여 수행됨.
• 항원 검출 : 라텍스 응집법 Pastorex Meningitis™(Bio-Rad, France)에 의해 항원(폐렴연쇄상구균, 인플루엔자, Neisseria meningitides group A, group B/Escherichia coli K1, group C 및 group Y/135, Streptococcus agalactiae)을 검출 .
• CSF 배양: 호기성 및 혐기성 플라스크와 헤마틴 플레이트에서 수행됩니다.
• 바이러스 검출 PCR: 헤르페스 바이러스 1형 및 2형(HSV1, HSV 2) 및 HZV DNA를 PCR로 검출하였다. 인간 엔테로바이러스(HEV)를 자동화 기기(Cepheid GeneXpert)로 분석했습니다.
• 통계 분석
• HGF 농도 및 결합 친화력 데이터가 정상적으로 분포되지 않기 때문에 비모수 검정 Kruskal-Wallis 검정과 Mann-Whitney U 검정 또는 Wilcoxon 일치 쌍 검정이 분석에 적합합니다. 테스트 성능 분석은 수동으로 수행해야 합니다.

Dextran Sulphate-Containing Gel에서 플랫폼의 임상 평가 Reverse Methachromacy 접근법을 사용하여 총 656개의 대변 샘플을 연구했습니다. 민감도, 특이성, 양성 예측값, 음성 예측값 및 정확도는 다음 그룹에서 계산되었습니다. : 확인된 감염성 위장염(n=207) 및 IBD를 포함한 기타 설사의 원인(n=268). 이 검사는 민감도 96.6%, 특이도 92.4%, 양성 예측도 90.9%, 음성 예측도 97.2%로 급성 감염성 위장염을 감별할 수 있었다. 검사 정확도는 94.3%였다. 검사 결과와 대변 칼프로텍틴 사이에는 유의한 상관관계가 발견되지 않았습니다(R2=0·056). 지수 검사 결과와 대변 내 혈액 존재 사이에는 유의한 상관관계가 관찰되지 않았다(R2=0·08)[20].

다른 원인의 백혈구증과 패혈성 뇌수막염을 구별하는 마커로서의 HGF의 임상 평가 [18] 지역사회 획득 패혈성 뇌수막염은 HGF 농도가 유의하게 더 높았고(p=0.0133), c-Met 및 HSPG 수용체에 대한 HGF 결합 친화도를 나타냈습니다. (각각 p=0.0007 및 p=0.0009) 병원성 수막염과 비교. 패혈성 수막염(지역사회 획득 및 병원내 감염 모두 포함) 환자의 CSF 샘플은 HGF 농도가 유의하게 더 높았습니다(p=0.0014). HSPG에 결합하는 HGF(p<0.0001) 및 c-Met에 결합하는 HGF(p<0.0001) 무균성(바이러스성 및 아급성) 수막염 환자의 샘플과 비교. 패혈성 수막염 환자의 CSF 샘플은 HGF 농도에서 대조군(정상 CSF 환자) 및 알츠하이머병 환자의 샘플보다 더 높았습니다(p<0.0001, 각각 p=0.0010), HSPG에 대한 HGF 결합(각각 p<0.0001 및 p=0.9) 및 c-Met에 대한 HGF 결합(모두 p<0.0001).

신경외과 수술을 받았고 다른 감염성 질환을 앓는 환자의 샘플과 비교할 때, 병원내 수막염 환자의 CSF 샘플은 HGF 농도(p<0.0001)와 c-Met(p<0.0001) 및 HSPG에 대한 HGF 결합 친화도(p= 0.043) 수용체(그림 3-4).

그림 범례 그림 1. HGF α 사슬 부분의 서열. 확대된 코돈은 HSPG 및 c-Met 수용체에 결합하는 데 중요한 아미노산을 코딩합니다.

그림 2. 감염 중에 체액에서 HGF의 존재를 감지하는 장치에 대한 두 번째 접근법에 대한 이론적 지원. (1) 음전하를 갖는 글루코사미노글리칸(GAG) 중합체 사슬. (2) 양성 TBO 분자는 폴리머 사슬에 부착된 다음 농축되어 스택을 형성합니다. 색상이 파란색에서 빨간색으로 바뀝니다. (3) GAG에 결합하는 HGF가 포함된 샘플이 추가됩니다. (4) TBO 분자 스택이 파괴되어 자유롭게 용해된 TBO 분자가 됩니다. 색상이 빨간색에서 파란색으로 바뀝니다.

그림 3: 환자 및 대조군에서 CSF 표본 선택의 흐름도. 추가 샘플은 병원성 수막염 환자로부터 병동에 머무는 동안 채취한 샘플입니다.

그림 4: 서로 다른 CSF 샘플에서 파생된 HGF의 특성을 표면 플라즈몬 및 ELISA 기술을 사용하여 분석했습니다. (A) c-Met 수용체에 대한 결합; (B) HSPG 수용체에 대한 결합; (C) HGF 농도(중앙값). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.

새로운 활성 약물의 개발 부족과 병행하여 항균제 내성 박테리아의 급속한 진화 및 확산은 특히 그람 음성 막대로 인한 박테리아 감염의 향후 항감염 치료에 심각한 영향을 미칩니다. 이 분야의 전문가들은 다음 10년까지 병원 안팎에서 치료할 수 없는(또는 거의 치료할 수 없는) 감염이 널리 퍼지는 것을 목격하게 될 것이라고 추정합니다. 이 위기를 피하거나 최소한 지연시키려는 시도를 하기 위해 많은 연구자들은 항생제 내성 박테리아의 출현과 세계적 확산에 유리한 요인을 밝히기 위해 노력했습니다. 다중 내성 변종의 출현을 제한하는 효과적인 전략에는 항생제로 치료해야 하거나 하지 말아야 할 사례를 식별하고 광범위한 항생제 투여를 피하고 보다 구체적인 치료를 촉진하여 항생제 치료를 지시하는 것이 포함될 수 있습니다.

필요한 것은 중요한 질문에 대답하는 간단하고 정확하며 비용 효율적이고 실행 가능한 테스트입니다.

이러한 테스트의 임상적 관련성과 성능을 평가하기 위해 거의 모든 환자에게 관련성 있고 현대적인 질병 평가 및 증거 기반 치료를 제공하는 스웨덴 의료보다 더 나은 환경은 없습니다. 이러한 환경은 배양, 혈액 검사 및 X-레이와 같은 가장 신뢰할 수 있는 표준 도구와 비교하여 연구 테스트의 환자 포함 및 평가를 수행할 수 있는 기회입니다. 이러한 리소스는 신뢰할 수 있고 비상업적이며 공정한 속성을 가진 다른 센터에서 자동으로 사용할 수 없습니다.

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