Prueba Rápida para la Detección del Foco de Infección en Pacientes Post Neuroquirúrgicos.

El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es una proteína local de fase aguda con propiedades regenerativas que se vuelve biológicamente inactiva durante la inflamación crónica y pierde la afinidad de unión con los glicosaminoglicanos en la matriz extracelular. El HGF se excreta en el tracto gastrointestinal y no se detecta en la orina normal. La meningitis nosocomial puede ocurrir cuando los procedimientos quirúrgicos cerebrales se complican por una infección. Debido a los procesos patológicos subyacentes del SNC ya los dispositivos del SNC in situ, los principales agentes de la meningitis bacteriana nosocomial difieren de los agentes de la meningitis adquirida en la comunidad. Por ejemplo, en las infecciones nosocomiales predominan los microorganismos oportunistas de crecimiento lento. El perfil de leucocitos del LCR se ve afectado por la hemorragia intracerebral y el lactato del LCR puede estar elevado debido a la isquemia. Además, la conciencia alterada puede dificultar el establecimiento de un diagnóstico en pacientes con ventiladores que desarrollan fiebre después de operaciones neuroquirúrgicas. En otras palabras, a menudo es difícil determinar si el cerebro lesionado ha sido invadido por la flora bacteriana ambiental.

Debido a los desafíos para establecer un diagnóstico y la falta de estándares de oro, los médicos están motivados para tratar las infecciones sospechosas en enfermedades graves con antibióticos de amplio espectro. Los problemas emergentes de las bacterias de resistencia múltiple, los altos costos y las complicaciones relacionadas con los nuevos antibióticos han requerido pruebas de diagnóstico que puedan minimizar el consumo de antibióticos.

En la actualidad, el diagnóstico de meningitis bacteriana sigue estando basado en métodos estándar de microscopía directa, análisis diferenciales de glóbulos blancos, lactato y proteínas, y cultivos de sangre y LCR. Sin embargo, las infecciones post-neuroquirúrgicas son difíciles de distinguir de los efectos de los procedimientos neuroquirúrgicos. Además, debido a los tratamientos profilácticos, los cultivos son negativos en un gran grupo de pacientes, y la presencia de flora cutánea, como Staphylococcus coagulasa negativo o Propionbacterium acnes, puede indicar infección o contaminación. La supervivencia de esta afección potencialmente mortal depende de un diagnóstico rápido y una terapia antibiótica empírica oportuna diseñada para cubrir los patógenos probables.

¿Dónde está el foco de infección? ¿Es una meningitis bacteriana (séptica)? ¿Está indicada la administración de antibióticos de amplio espectro? Antecedentes del proyecto: una invasión de bacterias en el sistema nervioso central (SNC) es seguida por un proceso inflamatorio de rápida evolución que afecta el espacio aracnoideo, la piamadre y el líquido cefalorraquídeo (LCR). Esta condición conduce a síntomas clínicos de dolor de cabeza, fiebre y meningismo. La respuesta inflamatoria es causada por la liberación de varias citocinas proinflamatorias de las células meníngeas al espacio subaracnoideo. Como resultado, los neutrófilos se mueven hacia el espacio subaracnoideo y causan pleocitosis en el LCR. Las consecuencias incluyen la ruptura de la barrera hematoencefálica, edema cerebral, reducción del flujo sanguíneo cerebral, áreas focales de hipoperfusión, trombosis vascular, isquemia, aumento del metabolismo de la glucosa a través de la vía glucolítica anaeróbica y aumento de la acumulación de lactato en el cerebro y el LCR. 1]. La supervivencia de esta afección potencialmente mortal depende de un diagnóstico rápido y una terapia antibiótica empírica oportuna diseñada para cubrir los patógenos probables.

Otras causas de meningitis febril incluyen la meningitis viral aguda y la meningitis no piógena, donde el cuadro clínico suele ser subagudo o crónico. Los procedimientos diagnósticos consisten en una punción lumbar para analizar el LCR en busca de células y bacterias, cultivos microbiológicos de sangre y LCR, pruebas serológicas que involucran PCR y detección de antígenos y técnicas radiográficas [2]. En la meningitis adquirida en la comunidad, una combinación de valores discriminatorios del análisis del LCR puede diferenciar la meningitis bacteriana aguda de otras causas no ambulatorias con una sensibilidad bastante alta [3].

La meningitis nosocomial puede ocurrir cuando los procedimientos quirúrgicos cerebrales se complican con una infección [2]. Debido a los procesos patológicos subyacentes del SNC ya los dispositivos del SNC in situ, los principales agentes de la meningitis bacteriana nosocomial difieren de los agentes de la meningitis adquirida en la comunidad. El perfil de leucocitos del LCR se ve afectado por la hemorragia intracerebral y el lactato del LCR puede estar elevado debido a la isquemia. Además, la conciencia alterada puede dificultar el establecimiento de un diagnóstico en pacientes con ventiladores que desarrollan fiebre después de operaciones neuroquirúrgicas.

El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es producido por células mesenquimales durante la lesión de órganos. Se produce como una proteína precursora de una sola cadena y se activa en el sitio de la lesión mediante escisión por proteólisis, lo que da como resultado una forma activa de cadena doble de HGF [4]. El HGF activo estimula la división celular [4] y la motilidad celular, y promueve la estructura morfogénica normal [5] en las células epiteliales adyacentes a las áreas lesionadas. Por lo tanto, HGF induce la regeneración y reparación del tejido dañado [6]. Se han detectado altos niveles de HGF sistémico durante lesiones causadas por infecciones [7]. En la meningitis bacteriana, la neumonía y la gastroenteritis bacteriana aguda, existe una producción local de HGF en el lugar de la infección [7-9]. El HGF producido localmente durante la infección bacteriana es biológicamente activo [10]. La aplicación de HGF biológicamente activo promovió la curación de úlceras crónicas en las piernas en un estudio piloto [11]. La terapia antibiótica efectiva reduce los niveles sistémicos de HGF durante la infección [12-13]. HGF podría considerarse como una proteína de fase aguda local con propiedades curativas [14].

La calidad de la unión del HGF endógeno a los receptores se puede evaluar con resonancia de plasmón superficial (SPR), una técnica óptica adecuada para estudios clínicos que pueden determinar la afinidad de una proteína por varios ligandos [15]. La evaluación basada en SPR de la afinidad de unión del HGF por sus receptores, c-Met y heparán sulfato proteoglicano (HSPG), podría distinguir de forma rápida y sensible las variantes de HGF con diferentes actividades biológicas [16-17].

Hemos estudiado previamente la concentración de HGF en LCR para pacientes con meningitis adquirida en la comunidad [7]. También hemos demostrado que la presencia de HGF biológicamente activo en el sitio de la lesión indica una inflamación local aguda [18]. Durante un estudio reciente, evaluamos si las concentraciones de HGF y la afinidad de unión de HGF por sus receptores podrían servir como marcadores para distinguir entre la meningitis asociada con la neurocirugía y otras causas de infección. Determinamos la concentración y la afinidad de unión de HGF en pacientes con meningitis adquirida en la comunidad o meningitis asociada a neurocirugía, y comparamos los resultados con pacientes con enfermedad de Alzheimer o controles con LCR normal. Hemos demostrado que la determinación de HGF en el LCR podría usarse como un indicador, complementario del estado clínico y los hallazgos de laboratorio de rutina, para diagnosticar la invasión bacteriana en el LCR en una etapa temprana de la enfermedad [18].

El problema:

Caso clínico: mujer de 76 años con hipertensión arterial fue encontrada por sus vecinos inconsciente en su jardín el 28 de octubre de 2009. La tomografía computarizada reveló hemorragia subaracnoidea y la neuroangiografía reveló 3 aneurismas. Ingresó en el Servicio de Neurocirugía y fue intervenida el 29 de octubre con drenaje ventricular y oclusión endovascular de los aneurismas. Fue extubada después de la cirugía, sin embargo, sufría de parálisis y cansancio en el brazo y la pierna izquierdos. Desde el 30 de octubre presenta fiebre baja y PCR y procalcitonina ligeramente elevadas. El líquido cefalorraquídeo mostró 170.000 glóbulos rojos y 630 glóbulos blancos y lactato 5,8. La radiografía de tórax mostró una infiltración sospechosa. Se aseguraron los cultivos de sangre y LCR. Los cultivos tomados a partir del 5 de noviembre revelaron un crecimiento significativo de Enterobacter cloacae y Staphylococcus aurous en orina y crecimiento de Staphylococcus aurous en la nasofaringe. No recibió antibioticoterapia y los parámetros disminuyeron espontáneamente pero continuó con bajo grado de fiebre. Los glóbulos del LCR aumentaron a 23000 glóbulos rojos y 106 glóbulos blancos (11 de noviembre), y el lactato del LCR fue de 4,5 (drenaje lumbar). A pesar de que la PCR estaba en rango normal, recibió meropeneno 2g x 3 bajo sospecha de meningitis bacteriana. Primero, el 19 de noviembre, los cultivos de LCR tomados el 11 de noviembre revelaron crecimiento de Propionibacterium acnes. El régimen de antibióticos continuó hasta el 23 de noviembre. Sufría de desorientación, fatiga y tenía hidrocefalia. Se sometió a una operación de derivación el 23 de noviembre. Murió el 2 de diciembre de 2009. Se encontró una alta concentración de HGF y una elevada afinidad de unión a HSPG en el análisis del LCR ya el 2 de noviembre.

Debido a los desafíos para establecer un diagnóstico y la falta de estándares de oro, los médicos están motivados para tratar las infecciones sospechosas individualmente porque no existe un método de diagnóstico que pueda identificar el foco de la infección a tiempo. La PCR para el panel bacteriano y la detección de virus en LCR es un método sensible. Sin embargo, también podría detectar las bacterias colonizadas. La presencia de bacterias no es lo mismo que una infección. Por lo tanto, en los casos de meningitis bacteriana, especialmente después de una cirugía cerebral y los cuerpos extraños que se insertan en el cerebro, no podemos confiar totalmente en cultivos positivos o negativos. Un método complementario (para los métodos estándar disponibles en el laboratorio) con alto valor predictivo negativo aumenta la especificidad de las pruebas y disminuye los costos, el tiempo y las complicaciones como las infecciones adquiridas en el hospital (IAH) profundamente.

El Método, Metacromacia Inversa:

El N-terminal de HGF (Hairpin Loop) ha sido identificado como el sitio de unión tanto para c-Met como para HSPG. Existe una alta correlación entre la unión de HGF a HSPG y al sulfato de dextrano en el sistema SPR (fig. 1). La metocromasia es un cambio de color característico que muestran ciertos colorantes de anilina cuando se unen a sustancias cromotrópicas [19]. Este fenómeno se ha utilizado ampliamente en el estudio de secciones de tejido. El azul de metileno (O-toluidina) se considera un colorante metacromático excelente. Al unirse a polisacáridos de alto peso molecular, como el sulfato de dextrano, el color de la solución indicadora cambia de azul a rojo [19].

Las combinaciones de sulfato de dextrano y O-toluidina en diferentes proporciones producen soluciones de color rojo púrpura de intensidad variable. Los papeles de filtro personalizados recubiertos conforman superficies que se colocan en tiras. Cuando está en contacto con soluciones biológicas, la muestra de HGF reemplaza competitivamente a la O-toluidina para unirse al sulfato de dextrano y el color de la superficie vuelve a ser azul (Fig. 2). Esta plataforma detecta la presencia de proteínas de unión a HSPG como HGF en fluidos corporales, incluidos expectorantes, orina, secreciones de úlceras, líquido cefalorraquídeo y derrame articular durante la infección. Las altas cantidades de proteína o el pH alto no provocan reacciones no específicas con este dispositivo.

El plan de estudio:

Líder del estudio: Amir Ramezani

El procedimiento:

Se recolectan muestras de LCR, orina y esputo (n=500) de pacientes (de 1 a 99 años) que se han sometido a cirugía de tumor cerebral, hemorragia intracerebral, disfunción de la derivación o fractura de cráneo. Las muestras se mantienen congeladas a -20°C hasta que se realizan los análisis. No hay criterios de exclusión.

Controla la enfermedad de Alzheimer (n=20)

• Se recogieron y congelaron muestras de LCR de pacientes (N=20) a los que se les diagnosticó la enfermedad de Alzheimer en la Clínica de la Memoria del Hospital Universitario de Skåne en Malmö. Los criterios revisados ​​del DSM-III y NINDS-ADRDA se utilizaron para el diagnóstico de la demencia de Alzheimer (este grupo de estudio se incluyó en un estudio anterior).
• LCR normal
• Este grupo está formado por pacientes a los que se les ha realizado una punción lumbar para descartar meningitis y tenían LCR normal.
• Análisis de la afinidad de unión de ligandos con resonancia de plasmones superficiales
• La actividad biológica de HGF se analiza con SPR. Medimos la afinidad de unión a HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) ya una quimera recombinante c-Met (R&D Systems), como se describió anteriormente.
• Mediciones de concentraciones de HGF en muestras Se utilizó un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) específico (inmunoensayo de HGF humano Quantikine, límite mínimo detectable: 0,04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) para determinar las concentraciones de HGF en LCR, esputo y orina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las mediciones se realizaron con un lector ELISA (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Austria) a 450 nm, que se calibró con las muestras de referencia de HGF humano recombinante y los estándares proporcionados en el kit.
• Metacromacia inversa La prueba de la tira de estudio se realiza en todas las muestras.
• Evaluaciones de laboratorio de rutina
• El LCR se analiza para determinar los valores de los parámetros en los Departamentos de Química Clínica, Hospitales Universitarios, en Linköping. Todos los cultivos, ensayos de PCR, ensayos de detección de antígenos y evaluaciones serológicas se realizan en el Departamento de Microbiología del Hospital Universitario de Linköping, Suecia.
• Células del LCR: Realizadas mediante microscopía de contraste de fase manual (Zeiss) utilizando la Cámara de Jessen para contar el número de eritrocitos y leucocitos (neutrófilos polimorfonucleares y monocitos).
• Lactato en LCR: Realizado con un analizador de gases en sangre de sobremesa ABL 800 (Radiometer Medical ApS Dinamarca).
• Detección de antígenos: El antígeno (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides grupo A, grupo B/Escherichia coli K1, grupo C y grupo Y/135, Streptococcus agalactiae) se detecta mediante el método de aglutinación de látex Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Francia) .
• Cultivo de LCR: Realizado en matraces aerobios y anaerobios así como en placas de hematina.
• PCR de detección de virus: se detectaron virus del herpes tipo 1 y 2 (HSV1, HSV 2) y ADN de HZV mediante PCR. El enterovirus humano (HEV) se analizó mediante un instrumento automatizado (Cepheid GeneXpert).
• análisis estadístico
• Debido a que las concentraciones de HGF y los datos de afinidad de unión no se distribuyen normalmente, las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis seguidas de la prueba U de Mann-Whitney o la prueba de pares emparejados de Wilcoxon son apropiadas para el análisis. El análisis del rendimiento de la prueba se realizará manualmente.

Evaluación clínica de la plataforma en un gel que contiene sulfato de dextrano Utilizando el enfoque de metacromacia inversa, hemos estudiado un total de 656 muestras de heces con La sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo y el valor predictivo negativo, así como la precisión, se calcularon en los siguientes grupos : gastroenteritis infecciosa verificada (n=207) y otras causas de diarrea, incluida la EII (n=268). La prueba pudo distinguir la gastroenteritis infecciosa aguda con una sensibilidad del 96,6 % y una especificidad del 92,4 %, y un valor predictivo positivo del 90,9 % y un valor predictivo negativo del 97,2 %. La precisión de la prueba fue del 94,3%. No se encontró una correlación significativa entre los resultados de la prueba y la calprotectina en heces (R2=0·056). No se observó una correlación significativa entre los resultados de la prueba índice y la presencia de sangre en las heces (R2=0·08) [20].

Evaluación clínica de HGF como marcador para distinguir la meningitis séptica de otras causas de pleocitosis [18] La meningitis séptica adquirida en la comunidad mostró una concentración de HGF significativamente más alta (p = 0,0133), así como una afinidad de unión de HGF a los receptores c-Met y HSPG (p=0,0007 y p=0,0009, respectivamente) en comparación con la meningitis nosocomial. Las muestras de LCR de pacientes con meningitis séptica (incluidas las adquiridas en la comunidad y nosocomiales) fueron significativamente más altas en las concentraciones de HGF (p = 0,0014), Unión de HGF a HSPG (p<0,0001) y unión de HGF a c-Met (p<0,0001) en comparación con muestras de pacientes con meningitis aséptica (viral y subaguda). Las muestras de LCR de pacientes con meningitis séptica fueron más altas que las muestras del grupo de control (pacientes con LCR normal) y de pacientes con enfermedad de Alzheimer en la concentración de HGF (p<0,0001, p=0,0010, respectivamente), unión de HGF a HSPG (p<0,0001 yp=0,9, respectivamente) y unión de HGF a c-Met (ambos p<0,0001).

En comparación con muestras de pacientes que se habían sometido a neurocirugía y tenían otras enfermedades infecciosas, las muestras de LCR de pacientes con meningitis nosocomial tenían concentraciones de HGF significativamente más altas (p<0,0001) y afinidad de unión de HGF a c-Met (p<0,0001) y HSPG (p= 0.043) receptores (Figura 3-4).

Figura Leyendas Fig. 1. Secuencia de parte de la cadena α de HGF. Los codones agrandados codifican aminoácidos importantes para unirse a HSPG y al receptor c-Met.

Fig. 2. El apoyo teórico para el segundo enfoque de un dispositivo para detectar la presencia de HGF en fluidos corporales durante una infección. (1) Cadena polimérica de glucosaminoglucano (GAG) con cargas negativas. (2) Las moléculas de TBO positivas se unen a la cadena de polímero y luego se concentran y forman pilas. El color cambia de azul a rojo. (3) Se añade una muestra con HGF, que se une a GAG. (4) Las pilas de moléculas de TBO se destruyen y se convierten en moléculas de TBO que se disuelven libremente. El color cambia de rojo a azul.

Figura 3: Diagrama de flujo de la selección de muestras de LCR de grupos de pacientes y controles. Las muestras extra son las tomadas durante la estancia en planta de pacientes con meningitis nosocomial.

Figura 4: Las propiedades del HGF derivado de diferentes muestras de LCR se analizaron utilizando técnicas de plasmón de superficie y ELISA. (A) Unión a receptores c-Met; (B) Unión a receptores HSPG; (C) Concentraciones de HGF (mediana). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0,0001.

La rápida evolución y propagación de bacterias resistentes a los antimicrobianos, junto con el desarrollo insuficiente de nuevos fármacos activos, afectan gravemente a la futura terapia antiinfecciosa de las infecciones bacterianas, especialmente las debidas a bacilos gramnegativos. Los expertos en el campo estiman que para la próxima década el mundo habrá sido testigo de la amplia diseminación de infecciones intratables (o casi intratables), tanto dentro como fuera de los hospitales. Para evitar o al menos intentar retrasar esta crisis, muchos investigadores han dedicado sus esfuerzos a dilucidar los factores que favorecen la aparición y propagación mundial de bacterias resistentes a los antimicrobianos. Una estrategia eficaz para limitar la aparición de cepas resistentes múltiples podría incluir dirigir la terapia antibiótica identificando los casos que deben o no tratarse con antibióticos, evitando la administración de antibióticos de amplio espectro y promoviendo tratamientos más específicos.

Lo que se necesita es una prueba simple, precisa, rentable y factible que responda a preguntas cruciales.

Para evaluar la relevancia clínica y el rendimiento de una prueba de este tipo, no hay mejor entorno que el sistema sanitario sueco, que proporciona una evaluación relevante y moderna de las enfermedades y un tratamiento basado en la evidencia para casi todos los pacientes. Dicho entorno es una oportunidad para realizar la inclusión del paciente y la evaluación de la prueba del estudio en comparación con las herramientas estándar más confiables, como cultivos, análisis de sangre y radiografías. Estos recursos no están disponibles automáticamente en ningún otro centro con propiedades tan fiables, no comerciales e imparciales.

dr 2015-429-32