Rychlý test pro detekci ohniska infekce u postneurochirurgických pacientů.

Hepatocytový růstový faktor (HGF) je lokální protein akutní fáze s regeneračními vlastnostmi, který se během chronického zánětu stává biologicky neaktivní a ztrácí vazebnou afinitu ke glykosaminoglykanu v extracelulární matrici. HGF je vylučován do gastrointestinálního traktu a není detekován v normální moči. Nozokomiální meningitida se může objevit, když jsou chirurgické zákroky na mozku komplikované infekcí. V důsledku základních chorobných procesů CNS a zařízení CNS in situ se hlavní původci nozokomiální bakteriální meningitidy liší od původců komunitní meningitidy. Například u nozokomiálních infekcí převládají pomalu rostoucí oportunní mikroorganismy. Leukocytový profil CSF je ovlivněn intracerebrálním krvácením a laktát v CSF může být zvýšený v důsledku ischemie. Kromě toho může změněné vědomí ztížit stanovení diagnózy u pacientů na ventilátorech, u kterých se po neurochirurgických operacích objeví horečka. Jinými slovy, je často obtížné určit, zda poraněný mozek byl napaden environmentální bakteriální flórou.

Vzhledem k problémům při stanovení diagnózy a nedostatku zlatých standardů jsou lékaři motivováni léčit podezření na infekce u závažných onemocnění širokospektrými antibiotiky. Objevující se problémy bakterií s mnohonásobnou rezistencí, vysoké náklady a komplikace související s novými antibiotiky si vyžádaly diagnostické testy, které mohou minimalizovat spotřebu antibiotik.

V současné době zůstává diagnostika bakteriální meningitidy založena na standardních metodách přímé mikroskopie, diferenciálních analýzách bílých krvinek, laktátu a bílkovin a kulturách krve a CSF. Postneurochirurgické infekce je však obtížné odlišit od účinků neurochirurgických postupů. Navíc díky profylaktické léčbě jsou kultury u velké skupiny pacientů negativní a přítomnost kožní flóry, jako je koaguláza negativní Staphylococcus nebo Propionbacterium acnes, může indikovat buď infekci, nebo kontaminaci. Přežití z tohoto život ohrožujícího stavu závisí na rychlé diagnóze a rychlé empirické antibiotické léčbě navržené tak, aby pokryla pravděpodobné patogeny.

Kde je ohnisko infekce? Jde o bakteriální (septickou) meningitidu? Je indikováno podávání širokospektrých antibiotik? Východiska projektu: Po invazi bakterií do centrálního nervového systému (CNS) následuje rychle se vyvíjející zánětlivý proces, který postihuje arachnoidální prostor, pia mater a mozkomíšní mok (CSF). Tento stav vede ke klinickým příznakům bolesti hlavy, horečky a meningismu. Zánětlivá odpověď je způsobena uvolněním různých prozánětlivých cytokinů z meningeálních buněk do subarachnoidálního prostoru. V důsledku toho se neutrofily přesouvají do subarachnoidálního prostoru a způsobují pleocytózu v CSF. Důsledky zahrnují porušení hematoencefalické bariéry, edém mozku, snížený průtok krve mozkem, ohniskové oblasti hypoperfuze, vaskulární trombózu, ischemii, zvýšený metabolismus glukózy prostřednictvím anaerobní glykolytické dráhy a zvýšenou akumulaci laktátu v mozku a CSF [ 1]. Přežití z tohoto život ohrožujícího stavu závisí na rychlé diagnóze a rychlé empirické antibiotické léčbě navržené tak, aby pokryla pravděpodobné patogeny.

Mezi další příčiny febrilní meningitidy patří akutní virová meningitida a nepyogenní meningitida, kde je klinický obraz typicky subakutní nebo chronický. Diagnostické postupy sestávají z lumbální punkce k analýze CSF na buňky a bakterie, mikrobiologických kultur krve a CSF, sérologických testů zahrnujících PCR a detekci antigenu a radiografických technik [2]. U komunitně získané meningitidy může kombinace rozlišujících hodnot z analýzy CSF odlišit akutní bakteriální meningitidu od jiných, ambulantních příčin s poměrně vysokou citlivostí [3].

Nozokomiální meningitida se může objevit, když jsou chirurgické zákroky na mozku komplikované infekcí [2]. V důsledku základních chorobných procesů CNS a zařízení CNS in situ se hlavní původci nozokomiální bakteriální meningitidy liší od původců komunitní meningitidy. Leukocytový profil CSF je ovlivněn intracerebrálním krvácením a laktát CSF může být zvýšený v důsledku ischemie. Kromě toho může změněné vědomí ztížit stanovení diagnózy u pacientů na ventilátorech, u kterých se po neurochirurgických operacích objeví horečka.

Hepatocytový růstový faktor (HGF) je produkován mezenchymálními buňkami během poškození orgánů. Je produkován jako jednořetězcový prekurzorový protein a je aktivován v místě poranění štěpením proteolýzou, což vede k dvouřetězcové aktivní formě HGF [4]. Aktivní HGF stimuluje buněčné dělení [4] a buněčnou motilitu a podporuje normální morfogenní strukturu [5] v epiteliálních buňkách sousedících s poraněnými oblastmi. HGF tedy indukuje regeneraci a opětovné párování poškozené tkáně [6]. Vysoké hladiny systémového HGF byly detekovány během poranění způsobených infekcí [7]. U bakteriální meningitidy, pneumonie a akutní bakteriální gastroenteritidy dochází k lokální produkci HGF v místě infekce [7–9]. HGF produkovaný lokálně během bakteriální infekce je biologicky aktivní [10]. Aplikace biologicky aktivního HGF v pilotní studii podpořila hojení chronických bércových vředů [11]. Efektivní antibiotická terapie snižuje systémové hladiny HGF během infekce [12–13]. HGF lze považovat za lokální protein akutní fáze s hojivými vlastnostmi [14].

Kvalita vazby endogenního HGF na receptory může být hodnocena pomocí povrchové plasmonové rezonance (SPR), což je optická technika vhodná pro klinické studie, která může určit afinitu proteinu k několika ligandům [15]. Hodnocení vazebné afinity HGF k jeho receptorům, c-Met a heparan sulfát proteoglykan (HSPG), založené na SPR, by mohlo rychle a citlivě rozlišit varianty HGF s různými biologickými aktivitami [16–17].

Již dříve jsme studovali koncentraci HGF v CSF u pacientů s komunitně získanou meningitidou [7]. Také jsme ukázali, že přítomnost biologicky aktivního HGF v místě poranění indikuje akutní lokální zánět [18]. Během nedávné studie jsme hodnotili, zda koncentrace HGF a vazebná afinita HGF k jeho receptorům mohou sloužit jako markery pro rozlišení mezi meningitidou spojenou s neurochirurgií a jinými příčinami infekce. Stanovili jsme koncentraci a vazebnou afinitu HGF u pacientů buď s komunitní meningitidou nebo meningitidou spojenou s neurochirurgií, a výsledky jsme porovnali buď s pacienty s Alzheimerovou chorobou nebo s kontrolami s normálním CSF. Ukázali jsme, že stanovení HGF v CSF může být použito jako indikátor, doplňující klinický stav a rutinní laboratorní nálezy, pro diagnostiku bakteriální invaze do CSF ​​v časné fázi onemocnění [18].

Problém:

Kazuistika: 76letou ženu s vysokým krevním tlakem našli její sousedé v bezvědomí na její zahradě 28. října 2009. CT vyšetření odhalilo subarachnoidální krvácení a neuroangiografie odhalila 3 aneuryzmata. Byla přijata na neurochirurgické oddělení a 29. října byla operována s komorovou drenáží a endovaskulární okluzí aneuryzmat. Po operaci byla extubována, ale trpěla ochrnutím levé paže a nohy a únavou. Od 30. října měla nízký stupeň horečky a mírně zvýšené CRP a prokalcitonin. Mozkomíšní mok vykazoval 170 000 červených a 630 bílých krvinek a laktát 5,8. Rentgen hrudníku ukázal podezření na infiltraci. Krev a kultury mozkomíšního moku byly zajištěny. Kultivace odebrané od 5. listopadu odhalily významný růst Enterobacter cloacae a Staphylococcus aurous v moči a růst Staphylococcus aurous v nosohltanu. Nedostala žádná antibiotika a parametry se spontánně snížily, ale nízký stupeň horečky pokračoval. Počet krvinek v CSF se zvýšil na 23 000 červených a 106 bílých krvinek (11. listopadu) a laktát v CSF byl 4,5 (lumbální drenáž). Přestože CRP bylo v normálním rozmezí, dostala meropenen 2g x 3 s podezřením na bakteriální meningitidu. Nejprve 19. listopadu kultury CSF odebrané 11. listopadu odhalily růst Propionibacterium acnes. Antibiotický režim pokračoval až do 23. listopadu. Trpěla dezorientací, únavou a měla hydrocefalus. 23. listopadu podstoupila operaci shuntu. Zemřela 2.12.2009. Vysoká koncentrace HGF a zvýšená vazebná afinita k HSPG byla zjištěna v CSF analýze již 2. listopadu.

Vzhledem k problémům při stanovení diagnózy a nedostatku zlatých standardů jsou lékaři motivováni léčit podezření na infekce individuálně, protože neexistuje žádná diagnostická metoda, která by dokázala včas identifikovat ohnisko infekce. PCR pro bakteriální panel a detekci virů v CSF je citlivá metoda. Může však také detekovat kolonizované bakterie. Přítomnost bakterií není totéž co infekce. Proto v případech bakteriální meningitidy, zejména po operaci mozku a cizích těles, která jsou vložená do mozku, nemůžeme zcela spoléhat na pozitivní nebo negativní kultury. Doplňková metoda (ke standardním dostupným metodám v laboratoři) s vysokou negativní prediktivní hodnotou zvyšuje specificitu testů a výrazně snižuje náklady, čas a komplikace, jako jsou nemocniční infekce (HAI).

Metoda, reverzní metachromacie:

N-konec HGF (Hairpin Loop) byl identifikován jako vazebné místo jak pro c-Met, tak pro HSPG. V systému SPR existuje vysoká korelace mezi vazbou HGF na HSPG a na dextransulfát (obr. 1). Metochromázie je charakteristická změna barvy, kterou vykazují některá anilinová barviva, když jsou navázána na chromotropní látky [19]. Tento jev je široce používán při studiu tkáňových řezů. Methylenová modř (O-toluidin) je považována za vynikající metachromatické barvivo. Po navázání na vysokomolekulární polysacharidy, jako je dextransulfát, se barva roztoku indikátoru změní z modré na červenou [19].

Kombinace dextransulfátu a O-toluidinu v různých poměrech produkují purpurově červeně zbarvené roztoky různé intenzity. Potažené přizpůsobené filtrační papíry tvoří povrchy, které jsou umístěny na pásech. Když je vzorek HGF v kontaktu s biologickými roztoky, kompetitivně nahrazuje O-toluidin pro vazbu na dextransulfát a barva povrchu se vrací do modré (obr. 2). Tato platforma detekuje přítomnost HSPG-vazebných proteinů, jako je HGF, v tělesných tekutinách včetně expektorans, moči, vředových sekretů, mozkomíšního moku a kloubního výpotku během infekce. Vysoké množství bílkovin nebo vysoké pH nezpůsobují u tohoto zařízení nespecifické reakce.

Studijní plán:

Vedoucí studie: Amir Ramezani

Postup:

Vzorky CSF, moč a sputum (n=500) se odebírají od pacientů (1-99 let), kteří podstoupili operaci mozkového nádoru, intracerebrální krvácení, dysfunkci zkratu nebo zlomeninu lebky. Vzorky jsou uchovávány zmrazené při -20 °C až do provedení analýz. Neexistují žádná kritéria vyloučení.

Kontroluje Alzheimerovu chorobu (n=20)

• Vzorky mozkomíšního moku byly odebrány a uchovávány zmrazené od pacientů (N=20), u kterých byla diagnostikována Alzheimerova choroba na klinice paměti, Skåne University Hospital v Malmö. Pro diagnostiku Alzheimerovy demence byla použita revidovaná kritéria DSM-III a NINDS-ADRDA (tato studijní skupina byla zahrnuta do předchozí studie).
• Normální CSF
• Tato skupina se skládá z pacientů, kteří podstoupili lumbální punkci k vyloučení meningitidy a měli normální CSF.
• Analýza vazebné afinity ligandu s povrchovou plazmonovou rezonancí
• Biologická aktivita HGF se analyzuje pomocí SPR. Měříme vazebnou afinitu k HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a k c-Met rekombinantní chiméře (R&D Systems), jak bylo popsáno dříve.
• Měření koncentrací HGF ve vzorcích Ke stanovení koncentrací HGF v mozkomíšním moku byla použita souprava specifického enzymového imunoanalýzy (ELISA) (Quantikine Human HGF immunoassay, minimální detekovatelný limit: 0,04 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), sputum a moč podle pokynů výrobce. Všechna měření byla provedena pomocí čtečky ELISA (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Rakousko) při 450 nm, která byla kalibrována s referenčními vzorky rekombinantního lidského HGF a standardy poskytnutými v soupravě.
• Reverzní metachromacie Test studijního proužku se provádí u všech vzorků.
• Rutinní laboratorní vyšetření
• CSF je analyzován za účelem stanovení hodnot parametrů na Oddělení klinické chemie Univerzitních nemocnic v Linköpingu. Všechny kultivace, PCR testy, testy detekce antigenu a sérologická hodnocení se provádějí na Ústavu mikrobiologie, Univerzitní nemocnice, Linköping, Švédsko.
• CSF-buňky: Provedeno manuální mikroskopií s fázovým kontrastem (Zeiss) s použitím Jessenovy komory pro počítání počtu erytrocytů a leukocytů (polymorfonukleárních neutrofilů a monocytů).
• Laktát CSF: Provedeno pomocí stolního analyzátoru krevních plynů ABL 800 (Radiometer Medical ApS Denmark).
• Detekce antigenu: Antigen (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides skupina A, skupina B/Escherichia coli K1, skupina C a skupina Y/135, Streptococcus agalactiae) je detekován latexovou aglutinační metodou Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Francie) .
• Kultivace CSF: Provádí se v aerobních a anaerobních baňkách a také na hematinových miskách.
• Detekce viru PCR: Herpes virus typu 1 a 2 (HSV1, HSV 2) a DNA HZV byly detekovány pomocí PCR. Lidský enterovirus (HEV) byl analyzován automatizovaným přístrojem (Cepheid GeneXpert).
• Statistická analýza
• Protože údaje o koncentracích HGF a vazebné afinitě nejsou normálně distribuovány, jsou pro analýzu vhodné neparametrické testy Kruskal-Wallisův test následovaný Mann-Whitney U testem nebo Wilcoxonovým párovým testem. Analýza provedení zkoušky se provádí ručně.

Klinické hodnocení platformy v gelu obsahujícím dextransulfát Pomocí přístupu reverzní metachromace jsme studovali celkem 656 vzorků stolice s citlivostí, specificitou, pozitivní prediktivní hodnotou a negativní prediktivní hodnotou a také přesností byly vypočteny v následujících skupinách : ověřená infekční gastroenteritida (n=207) a další příčiny průjmu, včetně IBD (n=268). Test dokázal rozlišit akutní infekční gastroenteritidu se senzitivitou 96,6 % a specificitou 92,4 % a pozitivní prediktivní hodnotou 90,9 % a negativní prediktivní hodnotou 97,2 %. Přesnost testu byla 94,3 %. Nebyla nalezena žádná významná korelace mezi výsledky testu a kalprotektinem ve stolici (R2=0,056). Nebyla pozorována žádná významná korelace mezi výsledky indexového testu a přítomností krve ve stolici (R2=0·08) [20].

Klinické hodnocení HGF jako markeru k odlišení septické meningitidy od jiných příčin pleocytózy [18] Komunitně získaná septická meningitida vykazovala významně vyšší koncentraci HGF (p=0,0133), stejně jako vazebnou afinitu HGF k c-Met a HSPG receptorům (p=0,0007, resp. p=0,0009) ve srovnání s nozokomiální meningitidou. Vzorky CSF od pacientů se septickou meningitidou (včetně komunitních i nozokomiálních) byly významně vyšší v koncentracích HGF (p=0,0014), Vazba HGF na HSPG (p<0,0001) a vazba HGF na c-Met (p<0,0001) ve srovnání se vzorky od pacientů s aseptickou (virovou a subakutní) meningitidou. Vzorky CSF od pacientů se septickou meningitidou byly vyšší než u vzorků z kontrolní skupiny (pacienti s normálním CSF) a od pacientů s Alzheimerovou chorobou v koncentraci HGF (p<0,0001, p=0,0010, v tomto pořadí), vazba HGF na HSPG (p<0,0001 a p=0,9, v daném pořadí) a vazba HGF na c-Met (obě p<0,0001).

Ve srovnání se vzorky od pacientů, kteří podstoupili neurochirurgický zákrok a měli jiná infekční onemocnění, měly vzorky CSF od pacientů s nozokomiální meningitidou významně vyšší koncentrace HGF (p<0,0001) a vazebnou afinitu HGF k c-Met (p<0,0001) a HSPG (p= 0,043) receptory (obrázek 3-4).

Legendy k obrázkům Obr. Sekvence části a-řetězce HGF. Zvětšené kodony kódují aminokyseliny důležité pro vazbu na HSPG a c-Met receptor.

Obr. 2. Teoretická podpora pro druhý přístup pro zařízení pro detekci přítomnosti HGF v tělesných tekutinách během infekce. (1) Glukosaminoglykanový (GAG) polymerní řetězec se zápornými náboji. (2) Pozitivní molekuly TBO se připojí k polymernímu řetězci, poté se koncentrují a tvoří shluky. Barva se změní z modré na červenou. (3) Přidá se vzorek s HGF, který se váže na GAG. (4) Shluky molekul TBO jsou zničeny a stávají se volně rozpuštěnými molekulami TBO. Barva se mění z červené na modrou.

Obrázek 3: Vývojový diagram výběru vzorků CSF z pacientských a kontrolních skupin. Extra vzorky jsou vzorky odebrané během pobytu na oddělení od pacientů s nozokomiální meningitidou.

Obrázek 4: Vlastnosti HGF odvozeného z různých vzorků CSF byly analyzovány pomocí povrchových plazmonů a technik ELISA. (A) Vazba na c-Met receptory; (B) Vazba na HSPG receptory; (C) Koncentrace HGF (medián). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

Rychlý vývoj a šíření antimikrobiálně rezistentních bakterií souběžně s nedostatečným vývojem nových aktivních léčiv vážně ovlivňuje budoucí antiinfekční terapii bakteriálních infekcí, zejména těch způsobených gramnegativními tyčinkami. Odborníci v této oblasti odhadují, že v příštím desetiletí bude svět svědkem rozsáhlého šíření neléčitelných (nebo téměř neléčitelných) infekcí, a to jak v nemocnicích, tak mimo ně. Aby se zabránilo této krizi nebo se ji alespoň pokusili zpomalit, mnoho výzkumníků věnovalo své úsilí objasnění faktorů podporujících vznik a globální šíření bakterií odolných vůči antimikrobiálním látkám. Účinná strategie pro omezení vzniku více rezistentních kmenů může zahrnovat nasměrování antibiotické terapie identifikací případů, které by měly nebo neměly být léčeny antibiotiky, vyhýbání se podávání širokospektrých antibiotik a prosazování specifičtější léčby.

Potřebujeme jednoduchý, přesný, nákladově efektivní a proveditelný test, který odpoví na zásadní otázky.

Pro posouzení klinické relevance a provedení takového testu neexistuje lepší prostředí než švédské zdravotnictví, které poskytuje relevantní a moderní hodnocení nemocí a terapii založenou na důkazech pro téměř všechny pacienty. Takové prostředí je příležitostí k provedení zahrnutí pacienta a vyhodnocení studijního testu ve srovnání s nejspolehlivějšími standardními nástroji, jako jsou kultivace, krevní testy a rentgenové snímky. Tyto zdroje nejsou automaticky dostupné v žádném jiném centru s tak spolehlivými, nekomerčními a nestrannými vlastnostmi.

dnr 2015-429-32