Gyorsteszt a fertőzés fókuszának kimutatására idegsebészeti beavatkozás utáni betegeknél.

A hepatocita növekedési faktor (HGF) egy regeneratív tulajdonságokkal rendelkező, helyi akut fázisú fehérje, amely krónikus gyulladás során biológiailag inaktívvá válik, és elveszíti kötőaffinitását a glikozaminoglikánhoz az extracelluláris mátrixban. A HGF kiválasztódik a gyomor-bél traktusba, és nem mutatható ki a normál vizeletben. Nosocomialis meningitis akkor fordulhat elő, ha az agysebészeti beavatkozásokat fertőzés bonyolítja. A központi idegrendszeri betegség hátterében álló folyamatok és az in situ központi idegrendszeri eszközök miatt a nozokomiális bakteriális agyhártyagyulladás fő kórokozói eltérnek a közösségben szerzett agyhártyagyulladás kórokozóitól. Például a nozokomiális fertőzésekben a lassan növekvő, opportunista mikroorganizmusok dominálnak. A CSF leukocita profilját befolyásolja az intracerebrális vérzés, és az ischaemia miatt a CSF-laktát megemelkedhet. Ezenkívül a megváltozott tudat megnehezítheti a diagnózis felállítását az idegsebészeti műtétek után lázas lélegeztetőgépet használó betegeknél. Más szavakkal, gyakran nehéz meghatározni, hogy a sérült agyat megszállta-e a környezeti baktériumflóra.

A diagnózis felállításának nehézségei és az aranystandardok hiánya miatt az orvosok motiváltak arra, hogy a súlyos betegségekben feltehető fertőzéseket széles spektrumú antibiotikumokkal kezeljék. A többszörösen rezisztens baktériumok felmerülő problémái, a magas költségek és az új antibiotikumokkal kapcsolatos szövődmények olyan diagnosztikai teszteket tesznek szükségessé, amelyek minimalizálhatják az antibiotikum-fogyasztást.

Jelenleg a bakteriális meningitis diagnosztizálása továbbra is a direkt mikroszkópos standard módszereken, a fehérvérsejtek, a laktát és a fehérjék differenciális elemzésén, valamint a vér és a cerebrospinalis folyadék tenyészetén alapul. Az idegsebészeti beavatkozások utáni fertőzéseket azonban nehéz megkülönböztetni az idegsebészeti eljárások hatásaitól. Sőt, a profilaktikus kezelések miatt a tenyészetek a betegek nagy csoportjában negatívak, és a bőrflóra jelenléte, mint például a Coagulase-negatív Staphylococcus vagy Propionbacterium acnes fertőzésre vagy szennyeződésre utalhat. Ennek az életveszélyes állapotnak a túlélése a gyors diagnózistól és az azonnali empirikus antibiotikum-terápiától függ, amelyet a valószínű kórokozók leküzdésére terveztek.

Hol van a fertőzés fókusza? Bakteriális (szeptikus) agyhártyagyulladás? Széles spektrumú antibiotikum adása javasolt? A projekt háttere: A baktériumok központi idegrendszerbe (CNS) való invázióját egy gyorsan fejlődő gyulladásos folyamat követi, amely az arachnoid teret, a pia mater-t és a cerebrospinális folyadékot (CSF) érinti. Ez az állapot fejfájás, láz és agyhártyagyulladás klinikai tüneteihez vezet. A gyulladásos választ az okozza, hogy a meningeális sejtekből a subarachnoidális térbe különböző gyulladást elősegítő citokinek szabadulnak fel. Ennek eredményeként a neutrofilek a subarachnoidális térbe költöznek, és pleocitózist okoznak a CSF-ben. A következmények közé tartozik a vér-agy gát lebomlása, agyödéma, csökkent agyi véráramlás, hipoperfúzió fókuszterületei, vaszkuláris trombózis, ischaemia, az anaerob glikolitikus úton megnövekedett glükóz-anyagcsere, valamint a fokozott laktát felhalmozódás az agyban és a CSF-ben. 1]. Ennek az életveszélyes állapotnak a túlélése a gyors diagnózistól és az azonnali empirikus antibiotikum-terápiától függ, amelyet a valószínű kórokozók leküzdésére terveztek.

A lázas agyhártyagyulladás egyéb okai közé tartozik az akut vírusos agyhártyagyulladás és a nem piogén agyhártyagyulladás, ahol a klinikai kép jellemzően szubakut vagy krónikus. A diagnosztikai eljárások lumbálpunkcióból állnak a cerebrospinalis folyadék sejtek és baktériumok szempontjából történő elemzésére, mikrobiológiai vér- és CSF-tenyészetekből, PCR-t és antigén-detektálást magában foglaló szerológiai tesztekből, valamint radiográfiás technikákból [2]. A közösségben szerzett meningitisben a CSF-analízisből származó megkülönböztető értékek kombinációja képes megkülönböztetni az akut bakteriális meningitist más, nem ambuláns okoktól, meglehetősen nagy érzékenységgel [3].

Nosocomialis meningitis akkor fordulhat elő, ha az agysebészeti beavatkozásokat fertőzés bonyolítja [2]. A központi idegrendszeri betegség hátterében álló folyamatok és az in situ központi idegrendszeri eszközök miatt a nozokomiális bakteriális agyhártyagyulladás fő kórokozói eltérnek a közösségben szerzett agyhártyagyulladás kórokozóitól. A CSF leukocita profilját befolyásolja az intracerebralis vérzés, és az ischaemia miatt a CSF-laktát megemelkedhet. Ezenkívül a megváltozott tudat megnehezítheti a diagnózis felállítását az idegsebészeti műtétek után lázas lélegeztetőgépet használó betegeknél.

A hepatocita növekedési faktort (HGF) a mezenchimális sejtek termelik szervkárosodás során. Egyláncú prekurzor fehérjeként termelődik, és a sérülés helyén proteolízis hasítással aktiválódik, ami a HGF kettős láncú aktív formáját eredményezi [4]. Az aktív HGF serkenti a sejtosztódást [4] és a sejtmozgást, és elősegíti a normál morfogén szerkezetet [5] a sérült területek melletti hámsejtekben. Így a HGF indukálja a regenerációt és a sérült szövetek újrapárosítását [6]. A fertőzés által okozott sérülések során magas szintű szisztémás HGF-et észleltek [7]. Bakteriális agyhártyagyulladás, tüdőgyulladás és akut bakteriális gasztroenteritisz esetén a fertőzés helyén helyi HGF termelés alakul ki [7-9]. A bakteriális fertőzés során lokálisan termelődő HGF biológiailag aktív [10]. A biológiailag aktív HGF alkalmazása elősegítette a krónikus lábszárfekélyek gyógyulását egy kísérleti tanulmányban [11]. A hatékony antibiotikum-terápia csökkenti a szisztémás HGF-szintet a fertőzés során [12-13]. A HGF egy helyi akut fázisú fehérjének tekinthető, amely gyógyító tulajdonságokkal rendelkezik [14].

Az endogén HGF receptorokhoz való kötődésének minősége a felszíni plazmonrezonanciával (SPR) mérhető, amely olyan klinikai vizsgálatokhoz megfelelő optikai technika, amely képes meghatározni egy fehérje affinitását számos ligandumhoz [15]. A receptoraihoz, a c-Met-hez és a heparán-szulfát-proteoglikánhoz (HSPG) való HGF-kötési affinitás SPR-alapú értékelése gyorsan és érzékenyen megkülönbözteti a különböző biológiai aktivitású HGF-változatokat [16-17].

Korábban tanulmányoztuk a HGF koncentrációját a CSF-ben közösségben szerzett meningitisben szenvedő betegeknél [7]. Azt is kimutattuk, hogy a biológiailag aktív HGF jelenléte a sérülés helyén akut lokális gyulladásra utal [18]. Egy közelmúltban végzett tanulmányunk során felmértük, hogy a HGF-koncentráció és a HGF-kötődési affinitás a receptoraihoz markerként szolgálhat-e az idegsebészettel összefüggő agyhártyagyulladás és a fertőzés egyéb okainak megkülönböztetésére. Meghatároztuk a HGF koncentrációját és kötődési affinitását a közösségben szerzett agyhártyagyulladásban vagy idegsebészettel összefüggő agyhártyagyulladásban szenvedő betegekben, és az eredményeket összehasonlítottuk Alzheimer-kórban szenvedő betegekkel vagy normál CSF-ben szenvedő kontrollokkal. Kimutattuk, hogy a CSF-ben a HGF meghatározása indikátorként használható, kiegészítve a klinikai állapotot és a rutin laboratóriumi eredményeket, a CSF-be való bakteriális invázió diagnosztizálására a betegség korai szakaszában [18].

A probléma:

Esetismertetés: Egy 76 éves magas vérnyomású nőt szomszédai találtak eszméletlenül a kertjében 2009. október 28-án. A CT vizsgálat subarachnoidális vérzést, a neuro-angiográfia pedig 3 aneurizmát tárt fel. Felvették az idegsebészeti osztályra, és október 29-én megoperálták kamrai drenázssal és az aneurizmák endovaszkuláris elzáródásával. A műtét után extubálták, azonban bal kar és láb bénulása és fáradtsága miatt szenvedett. Október 30. óta alacsony fokozatú láza volt, és kissé megemelkedett a CRP és a procalcitonin szintje. A cerebrospinális folyadékban 170 000 vörös és 630 fehérvérsejt és laktát 5,8 volt. A mellkas röntgenfelvétele gyanús beszivárgást mutatott ki. A vér- és a CSF-tenyészeteket rögzítettük. A november 5-től vett tenyészetek az Enterobacter cloacae és a Staphylococcus aurous jelentős növekedését mutatták ki a vizeletben, valamint a Staphylococcus aurous növekedését a nasopharynxben. Nem kapott antibiotikumos kezelést, és a paraméterek spontán csökkentek, de az alacsony láz továbbra is fennáll. A CSF-vérsejtek száma 23000 vörös- és 106 fehérvérsejtre nőtt (november 11.), a CSF-laktát pedig 4,5 volt (ágyéki elvezetés). Bár a CRP a normál tartományban volt, 2 g x 3 meropent kapott bakteriális agyhártyagyulladás gyanúja miatt. Először november 19-én a november 11-én vett CSF-tenyészetek Propionibacterium acnes növekedését mutatták ki. Az antibiotikum-kezelés november 23-ig folytatódott. Dezorientációtól, fáradtságtól és vízfejűségtől szenvedett. November 23-án söntműtéten esett át. 2009. december 2-án halt meg. A CSF-analízis során már november 2-án magas HGF-koncentrációt és megnövekedett kötődési affinitást találtak a HSPG-hez.

A diagnózis felállításának nehézségei és az aranystandardok hiánya miatt az orvosok motiváltak a fertőzésgyanús fertőzések egyéni kezelésében, mert nincs olyan diagnosztikai módszer, amellyel időben azonosítható lenne a fertőzési fókusz. A PCR a bakteriális panel és a vírus kimutatására CSF-ben érzékeny módszer. Ugyanakkor kimutathatja a kolonizált baktériumokat is. A baktériumok jelenléte nem azonos a fertőzéssel. Ezért bakteriális agyhártyagyulladás esetén, különösen agyműtét után, és az agyba juttatott idegen testek esetében nem támaszkodhatunk teljes mértékben a pozitív vagy negatív tenyészetekre. A magas negatív prediktív értékkel rendelkező kiegészítő módszer (a laboratóriumban elérhető standard módszerekhez) jelentősen növeli a vizsgálatok specifitását, és jelentősen csökkenti a költségeket, az időt és a szövődményeket, például a kórházi fertőzéseket (HAI).

A módszer, fordított metakromácia:

A HGF (Hairpin Loop) N-terminálisát a c-Met és a HSPG kötőhelyeként azonosították. Magas korreláció van a HGF HSPG-hez és dextrán-szulfáthoz való kötődése között az SPR rendszerben (1. ábra). A metokromázia jellegzetes színváltozás, amelyet bizonyos anilinfestékek kromotrop anyagokhoz kötve mutatnak [19]. Ezt a jelenséget széles körben alkalmazzák szövetmetszetek tanulmányozásában. A metilénkék (O-toluidin) kiváló metakromatikus festéknek számít. Nagy molekulatömegű poliszacharidokhoz, például dextrán-szulfáthoz való kötődéskor az indikátor oldat színe kékről vörösre változik [19].

A dextrán-szulfát és az O-toluidin különböző arányú kombinációi különböző intenzitású, bíborvörös színű oldatokat eredményeznek. A bevonatos testreszabott szűrőpapírok olyan felületeket alkotnak, amelyeket csíkokra helyeznek. Amikor biológiai oldatokkal érintkezik, a minta HGF kompetitív módon helyettesíti az O-toluidint a dextrán-szulfáthoz való kötődés érdekében, és a felület színe kékre tér vissza (2. ábra). Ez a platform érzékeli a HSPG-kötő fehérjék, például a HGF jelenlétét a testnedvekben, beleértve a köptetőt, a vizeletet, a fekélyváladékot, a cerebrospinális folyadékot és az ízületi folyadékgyülemet a fertőzés során. A nagy mennyiségű fehérje vagy a magas pH nem okoz nem specifikus reakciókat ezzel az eszközzel.

A tanulmányi terv:

Tanulmányvezető: Amir Ramezani

Az eljárás:

A CSF-mintákat, a vizeletet és a köpetet (n=500) olyan betegektől (1-99 évesek) gyűjtik, akik agydaganatos műtéten, intracerebrális vérzésen, shunt diszfunkción vagy koponyatörésen estek át. A mintákat az elemzések elvégzéséig -20°C-on fagyasztva tároljuk. Nincsenek kizárási kritériumok.

Kontrollálja az Alzheimer-kórt (n=20)

• A malmöi Skåne Egyetemi Kórház Memory Klinikáján Alzheimer-kórral diagnosztizált betegek (N=20) CSF-mintákat gyűjtöttek és fagyasztva tartottak. A felülvizsgált DSM-III és NINDS-ADRDA kritériumokat használták az Alzheimer-kór diagnosztizálására (ez a vizsgálati csoport szerepelt egy korábbi vizsgálatban).
• Normál CSF
• Ez a csoport olyan betegekből áll, akiknél az agyhártyagyulladás kizárása érdekében lumbálpunkciót végeztek, és normális CSF-vel rendelkeztek.
• A ligandumkötő affinitás elemzése felületi plazmonrezonanciával
• A HGF biológiai aktivitását SPR-rel elemezzük. Megmérjük a HSPG-hez (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és egy c-Met rekombináns kimérához (R&D Systems) való kötési affinitást, a korábban leírtak szerint.
• HGF-koncentráció mérése mintákban A CSF-ben a HGF-koncentráció meghatározására specifikus enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) készletet (Quantikine Human HGF immunoassay, minimális kimutatható határ: 0,04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) használtunk. köpet és vizelet a gyártó utasításai szerint. Minden mérést ELISA olvasóval (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Ausztria) végeztünk 450 nm-en, amelyet a rekombináns humán HGF referencia mintákkal és a készletben található standardokkal kalibráltak.
• Fordított metakromácia A vizsgálati csík tesztet minden mintán elvégzik.
• Rutin laboratóriumi vizsgálatok
• A CSF-t a linköpingi Egyetemi Kórházak Klinikai Kémiai Osztályain elemzik a paraméterértékek meghatározására. Minden tenyészetet, PCR-vizsgálatot, antigén-detektálási vizsgálatot és szerológiai vizsgálatot a Linköping-i Egyetemi Kórház Mikrobiológiai Osztályán végeznek.
• CSF-sejtek: Manuális fáziskontraszt mikroszkóppal (Zeiss) végezve Jessen Chamber segítségével az eritrociták és leukociták (polimorfonukleáris neutrofilek és monociták) számának megszámlálására.
• CSF-laktát: ABL 800 (Radiometer Medical ApS Denmark) asztali vérgáz-analizátorral végeztük.
• Antigén kimutatás: Az antigén (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides A csoport, B csoport/Escherichia coli K1, C csoport és Y/135 csoport, Streptococcus agalactiae) latex agglutinációs módszerrel detektálható Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Franciaország) .
• CSF-tenyésztés: Aerob és anaerob lombikban, valamint Hematin lemezeken végezzük.
• Vírus kimutatás PCR: Az 1-es és 2-es típusú herpeszvírust (HSV1, HSV 2) és a HZV DNS-t PCR-rel detektáltuk. A humán enterovírust (HEV) automatizált műszerrel (Cepheid GeneXpert) elemeztük.
• Statisztikai analízis
• Mivel a HGF-koncentrációk és a kötési affinitási adatok nem normálisan oszlanak meg, a nem parametrikus Kruskal-Wallis teszt, majd a Mann-Whitney U teszt vagy a Wilcoxon párosított teszt alkalmas az elemzéshez. A vizsgálati teljesítmény elemzését manuálisan kell elvégezni.

A platform klinikai értékelése dextrán-szulfát tartalmú gélben Fordított metakromácia megközelítéssel összesen 656 székletmintát vizsgáltunk meg. : igazolt fertőző gastroenteritis (n=207) és a hasmenés egyéb okai, beleértve az IBD-t (n=268). A teszt képes megkülönböztetni az akut fertőző gastroenteritist 96,6%-os szenzitivitással és 92,4%-os specificitással, valamint 90,9%-os pozitív prediktív értékkel és 97,2%-os negatív prediktív értékkel. A teszt pontossága 94,3% volt. Nem találtunk szignifikáns korrelációt a teszteredmények és a bélsár kalprotektin között (R2=0·056). Nem találtunk szignifikáns korrelációt az index teszt eredménye és a széklet vér jelenléte között (R2=0·08) [20].

A HGF mint marker klinikai értékelése a szeptikus meningitis és a pleocytosis egyéb okainak megkülönböztetésére [18] A közösségben szerzett szeptikus meningitis szignifikánsan magasabb HGF-koncentrációt (p=0,0133), valamint HGF-kötési affinitást mutatott a c-Met és HSPG receptorokhoz. (p=0,0007, illetve p=0,0009) a nozokomiális meningitishez képest. A szeptikus agyhártyagyulladásban szenvedő betegek CSF-mintái (beleértve a közösségben szerzett és a nozokomiálist is) szignifikánsan magasabbak voltak a HGF-koncentrációban (p=0,0014), HGF kötődése HSPG-hez (p<0,0001), és HGF kötődése c-Met-hez (p<0,0001) aszeptikus (vírusos és szubakut) meningitisben szenvedő betegek mintáihoz képest. A szeptikus meningitisben szenvedő betegek CSF-mintái magasabbak voltak a kontrollcsoport (normál CSF-ben szenvedő betegek) és az Alzheimer-kórban szenvedő betegek mintáiban HGF-koncentrációban (p<0,0001, p=0,0010, a HGF kötődése a HSPG-hez (p<0,0001 és p=0,9) és a HGF kötődése a c-Met-hez (mindkettő p<0,0001).

Az idegsebészeten átesett és más fertőző betegségben szenvedő betegek mintáihoz képest a nozokomiális meningitisben szenvedő betegek CSF-mintái szignifikánsan magasabb HGF-koncentrációt (p<0,0001) és HGF-kötési affinitást mutattak a c-Met-hez (p<0,0001) és a HSPG-hez (p=). 0,043) receptorok (3-4. ábra).

ábra Jelmagyarázatok 1. ábra. A HGF α-lánc egy részének szekvenciája. A megnagyobbodott kodonok olyan aminosavakat kódolnak, amelyek fontosak a HSPG-hez és a c-Met receptorhoz való kötődéshez.

2. ábra. A második megközelítés elméleti alátámasztása egy olyan eszközhöz, amely fertőzés során észleli a HGF jelenlétét a testnedvekben. (1) Glükózaminoglikán (GAG) polimerlánc negatív töltéssel. (2) A pozitív TBO-molekulák a polimerlánchoz kapcsolódnak, majd koncentrálódnak és halmokat képeznek. A szín kékről pirosra változik. (3) Hozzáadunk egy HGF-et tartalmazó mintát, amely a GAG-hoz kötődik. (4) A TBO-molekulahalmok megsemmisülnek, és szabadon oldódó TBO-molekulákká válnak. A szín pirosról kékre változik.

3. ábra: Folyamatábra a CSF-minták beteg- és kontrollcsoportokból történő kiválasztásáról. Az extra minták azok a minták, amelyeket a kórházi meningitisben szenvedő betegektől az osztályon való tartózkodás során vettek.

4. ábra: A különböző CSF-mintákból származó HGF tulajdonságait felületi plazmon és ELISA technikák alkalmazásával elemeztük. (A) kötődés c-Met receptorokhoz; (B) HSPG receptorokhoz való kötődés; (C) HGF-koncentrációk (medián). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

Az antimikrobiális rezisztens baktériumok gyors evolúciója és terjedése az új hatóanyagok elégtelen fejlesztésével párhuzamosan súlyosan befolyásolja a bakteriális fertőzések, különösen a Gram-negatív pálcikák okozta fertőzések jövőbeni fertőzésellenes kezelését. A terület szakértői úgy becsülik, hogy a következő évtizedben a világ tanúja lesz a kezelhetetlen (vagy éppen kezelhetetlen) fertőzések széles körű elterjedésének, mind a kórházakon belül, mind azon kívül. A válság elkerülése vagy legalábbis késleltetése érdekében sok kutató erőfeszítéseket tett az antimikrobiális rezisztens baktériumok megjelenését és globális terjedését elősegítő tényezők feltárására. A többszörösen rezisztens törzsek megjelenésének korlátozására szolgáló hatékony stratégia magában foglalhatja az antibiotikum-terápia irányítását az antibiotikumokkal kezelendő esetek azonosításával, a széles spektrumú antibiotikum beadás elkerülésével és a specifikusabb kezelések előmozdításával.

Egy egyszerű, pontos, költséghatékony és megvalósítható tesztre van szükség, amely választ ad a döntő kérdésekre.

Egy ilyen teszt klinikai jelentőségének és teljesítményének felmérésére nincs jobb környezet, mint a svéd egészségügyi ellátás, amely szinte minden beteg számára biztosítja a betegségek releváns és korszerű értékelését és bizonyítékokon alapuló terápiát. Egy ilyen környezet lehetőséget ad arra, hogy a legmegbízhatóbb szabványos eszközökkel, például tenyésztéssel, vérvizsgálattal és röntgensugarakkal összehasonlítva elvégezzük a vizsgálati tesztet a páciens bevonásával és értékelésével. Ezek az erőforrások nem érhetők el automatikusan más olyan központban, amely ilyen megbízható, nem kereskedelmi és pártatlan tulajdonságokkal rendelkezik.

dnr 2015-429-32