用于检测神经外科术后患者感染病灶的快速测试。

肝细 HGF 被排泄到胃肠道，在正常尿液中检测不到。 当脑外科手术因感染而复杂化时，可能会发生院内脑膜炎。 由于潜在的 CNS 疾病过程和原位 CNS 装置，院内细菌性脑膜炎的主要病原体不同于社区获得性脑膜炎的病原体。 例如，在院内感染中，生长缓慢的机会性微生物占主导地位。 CSF 白细胞概况受脑内出血的影响，并且由于缺血，CSF 乳酸可能升高。 此外，意识改变会使神经外科手术后使用呼吸机发烧的患者难以做出诊断。 换句话说，通常很难确定受伤的大脑是否已经被环境菌群侵入。

由于建立诊断的挑战以及缺乏金标准，医生有动力使用广谱抗生素治疗严重疾病中的疑似感染。 与新抗生素相关的多重耐药性细菌、高成本和并发症等新出现的问题要求进行可最大限度减少抗生素消耗的诊断测试。

目前，细菌性脑膜炎的诊断仍然基于直接显微镜检查、白细胞、乳酸和蛋白质的差异分析以及血液和脑脊液培养的标准方法。 然而，神经外科手术后的感染很难与神经外科手术的影响区分开来。 此外，由于预防性治疗，大量患者的培养呈阴性，并且皮肤菌群（如凝固酶阴性葡萄球菌或痤疮丙酸杆菌）的存在可能表明感染或污染。 从这种危及生命的疾病中幸存下来取决于快速诊断和及时的经验性抗生素治疗，旨在覆盖可能的病原体。

传染重点在哪里？ 是细菌性（化脓性）脑膜炎吗？ 是否需要使用广谱抗生素？ 项目背景：细菌侵入中枢神经系统 (CNS) 后，会出现快速发展的炎症过程，影响蛛网膜腔、软脑膜和脑脊液 (CSF)。 这种情况会导致头痛、发烧和脑膜炎等临床症状。 炎症反应是由各种促炎细胞因子从脑膜细胞释放到蛛网膜下腔引起的。 结果，嗜中性粒细胞进入蛛网膜下腔并导致脑脊液中的细胞增多。 其后果包括血脑屏障的破坏、脑水肿、脑血流减少、局灶性灌注不足、血管血栓形成、局部缺血、通过无氧糖酵解途径增强葡萄糖代谢，以及增加脑和脑脊液中的乳酸积累 [ 1]. 从这种危及生命的疾病中幸存下来取决于快速诊断和及时的经验性抗生素治疗，旨在覆盖可能的病原体。

发热性脑膜炎的其他原因包括急性病毒性脑膜炎和非化脓性脑膜炎，其临床表现通常为亚急性或慢性。 诊断程序包括腰椎穿刺以分析 CSF 中的细胞和细菌、血液和 CSF 的微生物培养、涉及 PCR 和抗原检测的血清学测试以及放射照相技术 [2]。 在社区获得性脑膜炎中，结合 CSF 分析的鉴别值可以以相当高的灵敏度将急性细菌性脑膜炎与其他非门诊病因区分开来 [3]。

当脑外科手术并发感染时，可能会发生院内脑膜炎 [2]。 由于潜在的 CNS 疾病过程和原位 CNS 装置，院内细菌性脑膜炎的主要病原体不同于社区获得性脑膜炎的病原体。 CSF 白细胞概况受脑内出血的影响，并且由于缺血，CSF 乳酸可能升高。 此外，意识改变会使神经外科手术后使用呼吸机发烧的患者难以做出诊断。

肝细胞生长因子 (HGF) 是由间充质细胞在器官损伤期间产生的。 它作为单链前体蛋白产生，并通过蛋白水解切割在损伤部位被激活，从而产生双链活性形式的 HGF [4]。 活性 HGF 刺激细胞分裂 [4] 和细胞运动，并促进损伤区域附近上皮细胞的正常形态结构 [5]。 因此，HGF 诱导受损组织的再生和修复 [6]。 在感染引起的损伤中检测到高水平的全身性 HGF [7]。 在细菌性脑膜炎、肺炎和急性细菌性胃肠炎中，感染部位局部产生 HGF [7-9]。 细菌感染期间局部产生的 HGF 具有生物活性 [10]。 在一项试点研究中，应用具有生物活性的 HGF 促进了慢性腿部溃疡的愈合 [11]。 有效的抗生素治疗可降低感染期间的全身 HGF 水平 [12-13]。 HGF 可能被视为具有愈合特性的局部急性期蛋白 [14]。

内源性 HGF 与受体结合的质量可以通过表面等离子共振 (SPR) 进行评估，这是一种适用于临床研究的光学技术，可以确定蛋白质对多种配体的亲和力 [15]。 基于 SPR 的 HGF 结合亲和力对其受体 c-Met 和硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (HSPG) 的评估可以快速、灵敏地区分具有不同生物活性的 HGF 变体 [16-17]。

我们之前研究过社区获得性脑膜炎患者 CSF 中 HGF 的浓度 [7]。 我们还表明，在损伤部位存在具有生物活性的 HGF 表明存在急性局部炎症 [18]。 在最近的一项研究中，我们评估了 HGF 浓度和 HGF 对其受体的结合亲和力是否可以作为区分神经外科相关脑膜炎和其他感染原因的标志物。 我们确定了 HGF 在社区获得性脑膜炎或神经外科相关性脑膜炎患者中的浓度和结合亲和力，并将结果与​​阿尔茨海默病患者或脑脊液正常的对照组进行了比较。 我们已经表明，CSF 中 HGF 的测定可作为一项指标，作为临床状态和常规实验室检查结果的补充，用于诊断疾病早期阶段 CSF 中的细菌侵入 [18]。

问题：

病例报告：2009 年 10 月 28 日，邻居发现一名 76 岁的高血压妇女在她的花园里昏迷不醒。 CT 扫描显示蛛网膜下腔出血，神经血管造影显示 3 个动脉瘤。 她被收入神经外科并于 10 月 29 日进行了脑室引流和动脉瘤血管内闭塞手术。 她在手术后拔管，但她患有左臂和腿部麻痹和疲倦。 自 10 月 30 日起，她出现低烧，CRP 和降钙素原略有升高。 脑脊液显示 170.000 个红细胞和 630 个白细胞以及乳酸 5.8。 胸部 X 光显示疑似浸润。 血液和脑脊液培养物是安全的。 11 月 5 日的培养显示尿液中阴沟肠杆菌和金黄色葡萄球菌显着生长，鼻咽部金黄色葡萄球菌生长。 她没有接受抗生素治疗，参数自发下降，但低烧仍在继续。 CSF 血细胞增加到 23000 个红细胞和 106 个白细胞（11 月 11 日），CSF 乳酸为 4.5（腰椎引流）。 尽管 CRP 在正常范围内，但她因怀疑患有细菌性脑膜炎而接受了 meropenen 2g x 3。 首先在 11 月 19 日，11 月 11 日采集的 CSF 培养物显示痤疮丙酸杆菌的生长。 抗生素方案一直持续到 11 月 23 日。 她患有迷失方向、疲劳和脑积水。 她于 11 月 23 日接受了分流手术。 她于 2009 年 12 月 2 日去世。 11 月 2 日就已在 CSF 分析中发现高浓度的 HGF 和升高的 HSPG 结合亲和力。

由于诊断困难和金标准的缺乏，由于没有能够及时识别感染病灶的诊断方法，医生有动力对疑似感染进行个体化治疗。 CSF 中细菌组和病毒检测的 PCR 是敏感的方法。 但是它也可以检测定植的细菌。 细菌的存在与感染不同。 因此，在细菌性脑膜炎的情况下，尤其是脑部手术后和插入大脑的异物，我们不能完全依赖阳性或阴性培养。 具有高阴性预测值的补充方法（针对实验室可用的标准方法）可提高检测的特异性，并显着降低成本、时间和并发症，例如医院获得性感染 (HAI)。

方法，反向异色性：

HGF 的 N 端（发夹环）已被确定为 c-Met 和 HSPG 的结合位点。 在 SPR 系统中，HGF 与 HSPG 和硫酸葡聚糖的结合之间存在高度相关性（图 1）。 间染是某些苯胺染料与显色物质结合时表现出的特征性颜色变化 [19]。这种现象已广泛用于组织切片的研究。 亚甲蓝（O-甲苯胺）被认为是一种极好的异染染料。 与高分子量多糖（如硫酸葡聚糖）结合后，指示剂溶液的颜色从蓝色变为红色 [19]。

不同比例的葡聚糖硫酸盐和邻甲苯胺的组合产生不同强度的紫红色溶液。 涂层定制滤纸构成放置在条带上的表面。 当与生物溶液接触时，样品 HGF 竞争性取代 O-甲苯胺以结合硫酸葡聚糖，表面颜色恢复为蓝色（图 2）。 该平台检测体液（包括痰、尿液、溃疡分泌物、脑脊液和感染期间的关节积液）中是否存在 HSPG 结合蛋白（例如 HGF）。 大量蛋白质或高 pH 值不会引起此设备的非特异性反应。

学习计划：

研究负责人：Amir Ramezani

步骤：

CSF标本、尿液和痰液（n=500）是从接受过脑肿瘤手术、脑出血、分流功能障碍或颅骨骨折的患者（1-99岁）中收集的。 样本在-20°C 下冷冻保存，直至进行分析。 没有排除标准。

控制阿尔茨海默病 (n=20)

• 从马尔默斯科讷大学医院记忆诊所被诊断患有阿尔茨海默氏病的患者 (N=20) 收集 CSF 样本并冷冻保存。 修订后的 DSM-III 和 NINDS-ADRDA 标准用于阿尔茨海默痴呆症的诊断（该研究组已纳入之前的研究）。
• 正常脑脊液
• 该组由接受腰椎穿刺排除脑膜炎且脑脊液正常的患者组成。
• 用表面等离子体共振分析配体结合亲和力
• HGF的生物学活性用SPR分析。 如前所述，我们测量了与 HSPG（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）和 c-Met 重组嵌合体（R＆D Systems）的结合亲和力。
• 样品中 HGF 浓度的测量使用特异性酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒（Quantikine 人 HGF 免疫测定，最小检测限：0.04 ng/mL；R&D Systems，明尼苏达州明尼苏达州明尼苏达州，美国）测定 CSF 中的 HGF 浓度，根据制造商的说明检查痰液和尿液。 所有测量均使用 ELISA 阅读器（Expert96；AsysHitech GmbH，Eugendorf，Austria）在 450 nm 处进行，该阅读器已使用重组人 HGF 参考样品和试剂盒中提供的标准进行校准。
• 反向异色性研究对所有标本进行试纸测试。
• 常规实验室评估
• 在林雪平大学附属医院的临床化学系对 CSF 进行分析以确定参数值。 所有培养、PCR 测定、抗原检测测定和血清学评估均在瑞典林雪平大学医院微生物学系进行。
• CSF-细胞：通过手动相差显微镜(Zeiss)使用Jessen Chamber进行，用于计算红细胞和白细胞(多形核嗜中性粒细胞和单核细胞)的数量。
• CSF 乳酸：使用台式血气分析仪 ABL 800（Radiometer Medical ApS Denmark）进行。
• 抗原检测：抗原（肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌 A 组、B 组/大肠杆菌 K1、C 组和 Y/135 组、无乳链球菌）通过乳胶凝集法 Pastorex Meningitis™（Bio-Rad，法国）检测.
• CSF 培养：在需氧菌和厌氧菌烧瓶以及血红素平板中进行。
• 病毒检测 PCR：通过 PCR 检测 1 型和 2 型疱疹病毒（HSV1、HSV 2）和 HZV DNA。 人肠道病毒 (HEV) 通过自动化仪器 (Cepheid GeneXpert) 进行分析。
• 统计分析
• 由于 HGF 浓度和结合亲和力数据不是正态分布的，非参数测试 Kruskal-Wallis 测试之后是 Mann-Whitney U 测试或 Wilcoxon 配对测试适合于分析。 测试性能的分析应手动进行。

平台在含葡聚糖硫酸盐的凝胶中的临床评估 我们使用反向异色法研究了总共 656 个粪便样本，灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值以及准确性在以下组中计算：经过验证的传染性胃肠炎 (n=207) 和其他腹泻原因，包括 IBD (n=268)。 该试验可区分急性感染性胃肠炎，敏感性为96.6%，特异性为92.4%，阳性预测值为90.9%，阴性预测值为97.2%。 测试准确率为94.3%。 检测结果与粪便钙卫蛋白无显着相关性（R2=0·056）。 在指标测试的结果与粪便中是否存在血液之间未观察到显着相关性 (R2=0·08) [20]。

HGF 作为区分脓毒性脑膜炎与其他原因引起的细胞增多症的标志物的临床评估 [18] 社区获得性脓毒性脑膜炎显示 HGF 浓度显着升高 (p=0.0133)，以及 HGF 与 c-Met 和 HSPG 受体的结合亲和力（分别为 p=0.0007 和 p=0.0009）与院内脑膜炎相比。 来自化脓性脑膜炎患者（包括社区获得性和医院获得性）的 CSF 样本中 HGF 浓度显着更高 (p=0.0014)， HGF 与 HSPG 的结合 (p<0.0001)，以及 HGF 与 c-Met 的结合 (p<0.0001) 与无菌性（病毒性和亚急性）脑膜炎患者的样本相比。 化脓性脑膜炎患者的 CSF 样本 HGF 浓度高于对照组（CSF 正常的患者）和阿尔茨海默病患者的样本（p<0.0001， p=0.0010，分别），HGF 与 HSPG 的结合（分别为 p<0.0001 和 p=0.9），以及 HGF 与 c-Met 的结合（均 p<0.0001）。

与来自接受过神经外科手术和患有其他传染病的患者的样本相比，来自院内脑膜炎患者的 CSF 样本具有显着更高的 HGF 浓度 (p<0.0001) 以及 HGF 与 c-Met (p<0.0001) 和 HSPG 的结合亲和力 (p= 0.043) 受体（图 3-4）。

图例 图 1。 HGF α 链部分序列。 扩大的密码子编码对结合 HSPG 和 c-Met 受体很重要的氨基酸。

图 2. 在感染期间检测体液中是否存在 HGF 的装置的第二种方法的理论支持。 (1) 带负电荷的葡糖胺聚糖（GAG）聚合物链。 (2)正TBO分子附着在聚合物链上然后被浓缩并形成堆叠。 颜色从蓝色变为红色。 (3) 添加具有 HGF 的样品，其与 GAG 结合。 (4) TBO分子堆被破坏，变成自由溶解的TBO分子。 颜色从红色变为蓝色。

图 3：从患者组和对照组中选择 CSF 标本的流程图。 额外样本是在院内脑膜炎患者住院期间采集的样本。

图 4：使用表面等离子体和 ELISA 技术分析了来自不同 CSF 样本的 HGF 的特性。 (A) 与 c-Met 受体的结合； (B) 与 HSPG 受体的结合； (C) HGF 浓度（中值）。 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001。

耐药菌的快速进化和传播以及新活性药物的开发不足严重影响了未来细菌感染的抗感染治疗，尤其是革兰氏阴性杆菌感染。 该领域的专家估计，到下一个十年，世界将目睹无法治愈（或几乎无法治愈）的感染在医院内外广泛传播。 为了避免或至少试图延缓这场危机，许多研究人员致力于阐明有利于抗菌素耐药性细菌出现和全球传播的因素。 限制多重耐药菌株出现的有效策略可能包括通过确定应该或不应该用抗生素治疗的病例来指导抗生素治疗，避免广谱抗生素给药，以及促进更具体的治疗。

所需要的是一种简单、准确、具有成本效益且可行的测试来回答关键问题。

为了评估此类测试的临床相关性和性能，没有比瑞典医疗保健更好的环境了，它为几乎所有患者提供相关的现代疾病评估和循证治疗。 与最可靠的标准工具（如培养、血液测试和 X 射线）相比，这样的环境是执行研究测试的患者纳入和评估的机会。 这些资源在具有如此可靠、非商业和公正属性的任何其他中心都无法自动获得。

DNR 2015-429-32