Test rapide pour la détection du foyer d'infection chez les patients post-neurochirurgicaux.

Le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) est une protéine de phase aiguë locale aux propriétés régénératives qui devient biologiquement inactive lors d'une inflammation chronique et perd l'affinité de liaison au glycosaminoglycane dans la matrice extracellulaire. Le HGF est excrété dans le tractus gastro-intestinal et n'est pas détecté dans l'urine normale. La méningite nosocomiale peut survenir lorsque les interventions chirurgicales cérébrales sont compliquées par une infection. En raison des processus sous-jacents de la maladie du SNC et des dispositifs du SNC in situ, les principaux agents de la méningite bactérienne nosocomiale diffèrent des agents de la méningite communautaire. Par exemple, dans les infections nosocomiales, les micro-organismes opportunistes à croissance lente prédominent. Le profil leucocytaire du LCR est affecté par l'hémorragie intracérébrale et le lactate de LCR peut être élevé en raison de l'ischémie. De plus, une altération de la conscience peut rendre difficile l'établissement d'un diagnostic chez les patients sous ventilateurs qui développent de la fièvre après des opérations neurochirurgicales. En d'autres termes, il est souvent difficile de déterminer si le cerveau lésé a été envahi par la flore bactérienne environnementale.

En raison des défis liés à l'établissement d'un diagnostic et du manque d'étalons-or, les médecins sont motivés pour traiter les infections suspectées dans les maladies graves avec des antibiotiques à large spectre. Les problèmes émergents des bactéries à résistance multiple, des coûts élevés et des complications liées aux nouveaux antibiotiques ont nécessité des tests de diagnostic qui peuvent minimiser la consommation d'antibiotiques.

Actuellement, le diagnostic de la méningite bactérienne reste basé sur les méthodes standard de microscopie directe, les analyses différentielles des globules blancs, du lactate et des protéines, et les cultures de sang et de LCR . Cependant, les infections post-neurochirurgicales sont difficiles à distinguer des effets des procédures neurochirurgicales. De plus, du fait des traitements prophylactiques, les cultures sont négatives chez un grand groupe de patients, et la présence de flore cutanée, comme Staphylococcus coagulase négatif ou Propionbacterium acnes, peut indiquer soit une infection, soit une contamination. La survie à cette maladie potentiellement mortelle dépend d'un diagnostic rapide et d'une antibiothérapie empirique rapide conçue pour couvrir les agents pathogènes probables.

Où se situe le foyer d'infection ? S'agit-il d'une méningite bactérienne (septique) ? L'administration d'antibiotiques à large spectre est-elle indiquée ? Le contexte du projet : Une invasion de bactéries dans le système nerveux central (SNC) est suivie d'un processus inflammatoire à évolution rapide qui affecte l'espace arachnoïdien, la pie-mère et le liquide céphalo-rachidien (LCR). Cette affection entraîne des symptômes cliniques de maux de tête, de fièvre et de méningisme. La réponse inflammatoire est causée par la libération de diverses cytokines pro-inflammatoires des cellules méningées dans l'espace sous-arachnoïdien. En conséquence, les neutrophiles se déplacent dans l'espace sous-arachnoïdien et provoquent une pléiocytose dans le LCR. Les conséquences comprennent la rupture de la barrière hémato-encéphalique, un œdème cérébral, une réduction du débit sanguin cérébral, des zones focales d'hypoperfusion, une thrombose vasculaire, une ischémie, une amélioration du métabolisme du glucose via la voie glycolytique anaérobie et une accumulation accrue de lactate dans le cerveau et le LCR. 1]. La survie à cette maladie potentiellement mortelle dépend d'un diagnostic rapide et d'une antibiothérapie empirique rapide conçue pour couvrir les agents pathogènes probables.

Les autres causes de méningite fébrile comprennent la méningite virale aiguë et la méningite non pyogénique, où le tableau clinique est généralement subaigu ou chronique. Les procédures de diagnostic consistent en une ponction lombaire pour analyser le LCR à la recherche de cellules et de bactéries, des cultures microbiologiques de sang et de LCR, des tests sérologiques impliquant la PCR et la détection d'antigènes et des techniques radiographiques [2]. Dans les méningites communautaires, une combinaison de valeurs discriminantes issues de l'analyse du LCR permet de différencier la méningite bactérienne aiguë des autres causes non ambulatoires avec une sensibilité assez élevée [3].

La méningite nosocomiale peut survenir lorsque les interventions chirurgicales cérébrales sont compliquées par une infection [2]. En raison des processus sous-jacents de la maladie du SNC et des dispositifs du SNC in situ, les principaux agents de la méningite bactérienne nosocomiale diffèrent des agents de la méningite communautaire. Le profil leucocytaire du LCR est affecté par l'hémorragie intracérébrale et le lactate de LCR peut être élevé en raison de l'ischémie. De plus, une altération de la conscience peut rendre difficile l'établissement d'un diagnostic chez les patients sous ventilateurs qui développent de la fièvre après des opérations neurochirurgicales.

Le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) est produit par les cellules mésenchymateuses lors de lésions organiques. Il est produit sous la forme d'une protéine précurseur à chaîne unique et il est activé au site de la lésion par clivage par protéolyse, ce qui donne une forme active à double chaîne de HGF [4]. Le HGF actif stimule la division cellulaire [4] et la motilité cellulaire, et il favorise la structure morphogénique normale [5] dans les cellules épithéliales adjacentes aux zones lésées. Ainsi, HGF induit la régénération et la ré-appariement des tissus endommagés [6]. Des niveaux élevés de HGF systémique ont été détectés lors de blessures causées par une infection [7]. Dans les méningites bactériennes, les pneumonies et les gastro-entérites bactériennes aiguës, il existe une production locale de HGF au site d'infection [7-9]. Le HGF produit localement lors d'une infection bactérienne est biologiquement actif [10]. L'application de HGF biologiquement actif a favorisé la cicatrisation des ulcères de jambe chroniques dans une étude pilote [11]. Une antibiothérapie efficace réduit les niveaux systémiques de HGF pendant l'infection [12-13]. Le HGF pourrait être considéré comme une protéine locale de phase aiguë avec des propriétés cicatrisantes [14].

La qualité de la liaison endogène du HGF aux récepteurs peut être évaluée par résonance plasmonique de surface (SPR), une technique optique appropriée pour les études cliniques qui permet de déterminer l'affinité d'une protéine pour plusieurs ligands [15]. L'évaluation basée sur la SPR de l'affinité de liaison du HGF pour ses récepteurs, le c-Met et le protéoglycane sulfate d'héparane (HSPG), pourrait distinguer rapidement et avec sensibilité les variants du HGF avec différentes activités biologiques [16-17].

Nous avons précédemment étudié la concentration de HGF dans le LCR chez des patients atteints de méningite communautaire [7]. Nous avons également montré que la présence de HGF biologiquement actif au site de la lésion indique une inflammation locale aiguë [18]. Au cours d'une étude récente, nous avons évalué si les concentrations de HGF et l'affinité de liaison de HGF pour ses récepteurs pourraient servir de marqueurs pour faire la distinction entre la méningite associée à la neurochirurgie et d'autres causes d'infection. Nous avons déterminé la concentration et l'affinité de liaison du HGF chez des patients atteints de méningite communautaire ou de méningite associée à la neurochirurgie, et comparé les résultats à des patients atteints de la maladie d'Alzheimer ou à des témoins avec un LCR normal. Nous avons montré que la détermination de l'HGF dans le LCR pouvait être utilisée comme indicateur, complémentaire de l'état clinique et des résultats de laboratoire de routine, pour diagnostiquer l'invasion bactérienne dans le LCR à un stade précoce de la maladie [18].

Le problème:

Rapport de cas : une femme de 76 ans souffrant d'hypertension artérielle a été retrouvée par ses voisins, inconsciente dans son jardin le 28 octobre 2009. Le scanner a révélé une hémorragie sous-arachnoïdienne et la neuro-angiographie a révélé 3 anévrismes. Elle a été admise au service de neurochirurgie et opérée le 29 octobre d'un drainage ventriculaire et d'une occlusion endovasculaire des anévrismes. Elle a été extubée après l'opération, mais elle souffrait de paralysie du bras et de la jambe gauche et de fatigue. Depuis le 30 octobre, elle avait une faible fièvre et une légère augmentation de la CRP et de la procalcitonine. Le liquide céphalo-rachidien a montré 170 000 globules rouges et 630 globules blancs et du lactate 5,8. La radiographie du thorax a montré une infiltration suspecte. Les cultures de sang et de LCR ont été sécurisées. Les cultures réalisées à partir du 5 novembre ont révélé une croissance significative d'Enterobacter cloacae et de Staphylococcus aurous dans les urines et une croissance de Staphylococcus aurous dans le nasopharynx. Elle n'a reçu aucune antibiothérapie et les paramètres ont diminué spontanément mais une faible fièvre a persisté. Les globules sanguins du LCR ont augmenté à 23 000 globules rouges et 106 globules blancs (11 novembre) et le lactate du LCR était de 4,5 (drainage lombaire). Bien que la CRP soit dans la plage normale, elle a reçu du méropène 2g x 3 sous suspicion de méningite bactérienne. Tout d'abord, le 19 novembre, les cultures de LCR prélevées le 11 novembre ont révélé la croissance de Propionibacterium acnes. Le régime antibiotique s'est poursuivi jusqu'au 23 novembre. Elle souffrait de désorientation, de fatigue et d'hydrocéphalie. Elle a subi une opération de shunt le 23 novembre. Elle est décédée le 2 décembre 2009. Une concentration élevée de HGF et une affinité de liaison élevée au HSPG ont été trouvées dans l'analyse du LCR déjà le 2 novembre.

En raison des difficultés à établir un diagnostic et du manque d'étalons-or, les médecins sont motivés à traiter les infections suspectées individuellement car il n'existe aucune méthode de diagnostic capable d'identifier le foyer d'infection à temps. La PCR pour le panel bactérien et la détection de virus dans le LCR est une méthode sensible. Cependant, il pourrait également détecter les bactéries colonisées. La présence de bactéries n'est pas synonyme d'infection. Par conséquent, dans les cas de méningite bactérienne, en particulier après une chirurgie cérébrale et les corps étrangers insérés dans le cerveau, nous ne pouvons pas nous fier totalement aux cultures positives ou négatives. Une méthode complémentaire (aux méthodes standard disponibles au laboratoire) à haute valeur prédictive négative augmente la spécificité des tests et diminue profondément les coûts, le temps et les complications telles que les infections nosocomiales (IAS).

La méthode, la méthachromie inverse :

L'extrémité N-terminale de HGF (Hairpin Loop) a été identifiée comme le site de liaison à la fois à c-Met et à HSPG. Il existe une forte corrélation entre la liaison du HGF au HSPG et au sulfate de dextran dans le système SPR (fig 1). La métochromasie est un changement de couleur caractéristique que certains colorants à l'aniline présentent lorsqu'ils sont liés à des substances chromotropes [19]. Ce phénomène a été largement utilisé dans l'étude des coupes de tissus. Le bleu de méthylène (O-toluidine) est considéré comme un excellent colorant métachromatique. Lors de la liaison à des polysaccharides de poids moléculaire élevé, tels que le sulfate de dextran, la couleur de la solution indicatrice passe du bleu au rouge [19].

Des combinaisons de sulfate de dextrane et d'O-toluidine dans des proportions différentes produisent des solutions colorées en rouge pourpre d'intensité variable. Les papiers filtres personnalisés enduits constituent des surfaces qui sont posées sur des bandes. Lorsqu'il est en contact avec des solutions biologiques, l'HGF de l'échantillon remplace de manière compétitive l'O-toluidine pour se lier au sulfate de dextran et la couleur de la surface redevient bleue (Fig 2). Cette plate-forme détecte la présence de protéines de liaison HSPG telles que HGF dans les fluides corporels, y compris l'expectorant, l'urine, les sécrétions d'ulcère, le liquide céphalo-rachidien et l'épanchement articulaire pendant l'infection. De grandes quantités de protéines ou un pH élevé ne provoquent pas de réactions non spécifiques avec cet appareil.

Le projet d'étude :

Responsable de l'étude : Amir Ramezani

La procédure:

Des échantillons de LCR, d'urine et de crachats (n = 500) sont prélevés chez des patients (âgés de 1 à 99 ans) ayant subi une chirurgie pour tumeur cérébrale, une hémorragie intracérébrale, un dysfonctionnement du shunt ou une fracture du crâne. Les échantillons sont conservés congelés à -20°C jusqu'à la réalisation des analyses. Il n'y a pas de critères d'exclusion.

Contrôle la maladie d'Alzheimer (n=20)

• Des échantillons de LCR ont été prélevés et conservés congelés chez des patients (N = 20) chez qui la maladie d'Alzheimer a été diagnostiquée à la clinique de la mémoire de l'hôpital universitaire de Skåne à Malmö. Les critères révisés du DSM-III et du NINDS-ADRDA ont été utilisés pour le diagnostic de la démence d'Alzheimer (ce groupe d'étude a été inclus dans une étude précédente).
• LCR normal
• Ce groupe est composé de patients qui ont subi une ponction lombaire pour exclure une méningite et qui avaient un LCR normal.
• Analyse de l'affinité de liaison au ligand avec la résonance plasmonique de surface
• L'activité biologique de HGF est analysée avec SPR. Nous mesurons l'affinité de liaison à HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et à une chimère recombinante c-Met (R&D Systems), comme décrit précédemment.
• Mesures des concentrations de HGF dans les échantillons Un kit spécifique ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Quantikine Human HGF immunoassay, minimum detectable limit: 0.04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) a été utilisé pour déterminer les concentrations de HGF dans le LCR, crachats et urines selon les instructions du fabricant. Toutes les mesures ont été effectuées avec un lecteur ELISA (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Autriche) à 450 nm, qui a été calibré avec les échantillons de référence de HGF humain recombinant et les normes fournies dans le kit.
• Méthachromie inverse Le test de la bandelette d'étude est effectué sur tous les échantillons.
• Évaluations de routine en laboratoire
• Le LCR est analysé pour déterminer les valeurs des paramètres dans les départements de chimie clinique des hôpitaux universitaires de Linköping. Toutes les cultures, les tests PCR, les tests de détection d'antigènes et les évaluations sérologiques sont effectués au Département de microbiologie, Hôpital universitaire, Linköping, Suède.
• Cellules de LCR : réalisées par microscopie à contraste de phase manuelle (Zeiss) en utilisant la chambre de Jessen pour compter le nombre d'érythrocytes et de leucocytes (neutrophiles polymorphonucléaires et monocytes).
• Lactate de LCR : effectué à l'aide d'un analyseur de gaz du sang de paillasse ABL 800 (Radiometer Medical ApS Danemark).
• Détection d'antigène : L'antigène (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides groupe A, groupe B/Escherichia coli K1, groupe C et groupe Y/135, Streptococcus agalactiae) est détecté par la méthode d'agglutination au latex Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, France) .
• Culture du LCR : effectuée dans des flacons aérobies et anaérobies ainsi que dans des plaques d'hématine.
• PCR de détection de virus : Les virus de l'herpès de type 1 et 2 (HSV1, HSV 2) et l'ADN du VZH ont été détectés par PCR. L'entérovirus humain (HEV) a été analysé par un instrument automatisé (Cepheid GeneXpert).
• analyses statistiques
• Étant donné que les concentrations de HGF et les données d'affinité de liaison ne sont pas normalement distribuées, des tests non paramétriques, le test de Kruskal-Wallis suivi du test U de Mann-Whitney ou du test de paires appariées de Wilcoxon, sont appropriés pour l'analyse. L'analyse des performances d'essai doit être effectuée manuellement.

Évaluation clinique de la plate-forme dans un gel contenant du sulfate de dextran En utilisant une approche de méthachromie inverse, nous avons étudié un total de 656 échantillons de fèces avec La sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative ainsi que la précision ont été calculées dans les groupes suivants : gastro-entérite infectieuse avérée (n=207) et autres causes de diarrhée dont MII (n=268). Le test pouvait distinguer la gastro-entérite infectieuse aiguë avec une sensibilité de 96,6 % et une spécificité de 92,4 %, ainsi qu'une valeur prédictive positive de 90,9 % et une valeur prédictive négative de 97,2 %. La précision du test était de 94,3 %. Aucune corrélation significative entre les résultats des tests et la calprotectine fécale n'a été trouvée (R2 = 0,056). Aucune corrélation significative n'a été observée entre les résultats du test index et la présence de sang dans les fèces (R2=0,08) [20].

Évaluation clinique du HGF en tant que marqueur pour distinguer la méningite septique des autres causes de pléocytose [18] La méningite septique acquise dans la communauté a montré une concentration de HGF significativement plus élevée (p = 0,0133), ainsi qu'une affinité de liaison du HGF aux récepteurs c-Met et HSPG (p = 0,0007 et p = 0,0009, respectivement) par rapport à la méningite nosocomiale. Les échantillons de LCR de patients atteints de méningite septique (y compris d'origine communautaire et nosocomiale) présentaient des concentrations de HGF significativement plus élevées (p = 0,0014), Liaison HGF à HSPG (p<0,0001) et liaison HGF à c-Met (p<0,0001) par rapport aux échantillons de patients atteints de méningite aseptique (virale et subaiguë). Les échantillons de LCR de patients atteints de méningite septique étaient plus élevés que ceux du groupe témoin (patients avec LCR normal) et de patients atteints de la maladie d'Alzheimer en concentration de HGF (p<0,0001, p = 0, 0010, respectivement), la liaison de HGF à HSPG (p <0, 0001 et p = 0, 9, respectivement) et la liaison de HGF à c-Met (les deux p <0, 0001).

Par rapport aux échantillons de patients ayant subi une neurochirurgie et souffrant d'autres maladies infectieuses, les échantillons de LCR de patients atteints de méningite nosocomiale avaient des concentrations de HGF significativement plus élevées (p<0,0001) et une affinité de liaison de HGF avec c-Met (p<0,0001) et HSPG (p= 0,043) récepteurs (Figure 3-4).

Légendes des figures Fig. 1. Séquence d'une partie de la chaîne a du HGF. Les codons agrandis codent pour des acides aminés importants pour la liaison à HSPG et au récepteur c-Met.

Fig. 2. Le support théorique de la deuxième approche pour un dispositif de détection de la présence de HGF dans les fluides corporels lors d'une infection. (1) Chaîne polymère de glucosaminoglycane (GAG) avec des charges négatives. (2) Les molécules TBO positives se fixent à la chaîne polymère puis sont concentrées et forment des empilements. La couleur passe du bleu au rouge. (3) Un échantillon avec HGF est ajouté, qui se lie à GAG. (4) Les piles de molécules TBO sont détruites et deviennent des molécules TBO librement dissoutes. La couleur passe du rouge au bleu.

Figure 3 : Organigramme de la sélection des échantillons de LCR des groupes de patients et de contrôle. Les échantillons supplémentaires sont les échantillons prélevés pendant le séjour des patients atteints de méningite nosocomiale.

Figure 4 : Les propriétés du HGF dérivé de différents échantillons de LCR ont été analysées à l'aide de techniques de plasmon de surface et d'ELISA. (A) Liaison aux récepteurs c-Met ; (B) Liaison aux récepteurs HSPG; (C) Concentrations de HGF (médiane). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

L'évolution rapide et la propagation des bactéries résistantes aux antimicrobiens parallèlement au développement insuffisant de nouveaux médicaments actifs affectent sérieusement la future thérapie anti-infectieuse des infections bactériennes, en particulier celles dues aux bâtonnets Gram-négatifs. Les experts dans le domaine estiment que d'ici la prochaine décennie, le monde aura été témoin de la large diffusion d'infections incurables (ou presque incurables), à la fois à l'intérieur et à l'extérieur des hôpitaux. Pour éviter ou du moins tenter de retarder cette crise, de nombreux chercheurs ont consacré leurs efforts à élucider les facteurs favorisant l'émergence et la propagation mondiale des bactéries résistantes aux antimicrobiens. Une stratégie efficace pour limiter l'émergence de souches multirésistantes pourrait consister à orienter l'antibiothérapie en identifiant les cas qui doivent ou non être traités avec des antibiotiques, en évitant l'administration d'antibiotiques à large spectre et en favorisant des traitements plus spécifiques.

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