Schnelltest zum Nachweis des Infektionsherdes bei postneurochirurgischen Patienten.

Der Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) ist ein lokales Akute-Phase-Protein mit regenerativen Eigenschaften, das während einer chronischen Entzündung biologisch inaktiv wird und die Bindungsaffinität zu Glycosaminoglycan in der extrazellulären Matrix verliert. HGF wird in den Gastrointestinaltrakt ausgeschieden und ist im normalen Urin nicht nachweisbar. Eine nosokomiale Meningitis kann auftreten, wenn chirurgische Eingriffe am Gehirn durch eine Infektion kompliziert werden. Aufgrund der zugrunde liegenden ZNS-Krankheitsprozesse und ZNS-Vorrichtungen in situ unterscheiden sich die Haupterreger der nosokomialen bakteriellen Meningitis von den Erregern der ambulant erworbenen Meningitis. Beispielsweise überwiegen bei nosokomialen Infektionen langsam wachsende, opportunistische Mikroorganismen. Das CSF-Leukozytenprofil wird durch intrazerebrale Blutungen beeinflusst, und das CSF-Laktat kann aufgrund von Ischämie erhöht sein. Darüber hinaus kann ein verändertes Bewusstsein die Diagnosestellung bei Beatmungspatienten erschweren, die nach neurochirurgischen Eingriffen Fieber entwickeln. Mit anderen Worten, es ist oft schwierig festzustellen, ob das verletzte Gehirn von einer Bakterienflora aus der Umgebung befallen wurde.

Aufgrund der Herausforderungen bei der Diagnosestellung und fehlender Goldstandards sind Ärzte motiviert, Verdachtsfälle bei schweren Erkrankungen mit Breitbandantibiotika zu behandeln. Die aufkommenden Probleme von mehrfach resistenten Bakterien, hohen Kosten und Komplikationen im Zusammenhang mit neuen Antibiotika haben diagnostische Tests erforderlich gemacht, die den Antibiotikaverbrauch minimieren können.

Derzeit basiert die Diagnose einer bakteriellen Meningitis weiterhin auf Standardmethoden der direkten Mikroskopie, Differentialanalysen von weißen Blutkörperchen, Laktat und Protein sowie Blut- und Liquorkulturen. Allerdings sind postneurochirurgische Infektionen schwer von den Auswirkungen neurochirurgischer Eingriffe zu unterscheiden. Darüber hinaus sind die Kulturen aufgrund von Prophylaxebehandlungen bei einer großen Gruppe von Patienten negativ, und das Vorhandensein einer Hautflora, wie Koagulase-negativer Staphylococcus oder Propionbacterium acnes, kann entweder auf eine Infektion oder Kontamination hinweisen. Das Überleben dieses lebensbedrohlichen Zustands hängt von einer schnellen Diagnose und einer sofortigen empirischen Antibiotikatherapie ab, die so konzipiert ist, dass sie die wahrscheinlichen Krankheitserreger abdeckt.

Wo liegt der Infektionsherd? Handelt es sich um eine bakterielle (septische) Meningitis? Ist die Gabe von Breitbandantibiotika indiziert? Der Hintergrund des Projekts: Einer Invasion von Bakterien in das Zentralnervensystem (ZNS) folgt ein sich rasch entwickelnder Entzündungsprozess, der den Arachnoidealraum, die Pia mater und die Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) betrifft. Dieser Zustand führt zu klinischen Symptomen wie Kopfschmerzen, Fieber und Meningismus. Die Entzündungsreaktion wird durch die Freisetzung verschiedener entzündungsfördernder Zytokine aus meningealen Zellen in den Subarachnoidalraum verursacht. Infolgedessen wandern Neutrophile in den Subarachnoidalraum und verursachen eine Pleozytose im Liquor. Die Folgen sind der Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke, zerebrale Ödeme, verminderte zerebrale Durchblutung, fokale Minderdurchblutung, Gefäßthrombose, Ischämie, verstärkter Glukosestoffwechsel über den anaeroben Glykolyseweg und verstärkte Laktatakkumulation im Gehirn und Liquor [ 1]. Das Überleben dieses lebensbedrohlichen Zustands hängt von einer schnellen Diagnose und einer sofortigen empirischen Antibiotikatherapie ab, die so konzipiert ist, dass sie die wahrscheinlichen Krankheitserreger abdeckt.

Andere Ursachen einer fieberhaften Meningitis sind die akute virale Meningitis und die nicht-pyogene Meningitis, bei denen das Krankheitsbild typischerweise subakut oder chronisch ist. Die diagnostischen Verfahren bestehen aus einer Lumbalpunktion zur Analyse des Liquors auf Zellen und Bakterien, mikrobiologischen Blut- und Liquorkulturen, serologischen Tests mit PCR und Antigennachweis sowie radiologischen Verfahren [2]. Bei ambulant erworbener Meningitis kann eine Kombination von Unterscheidungswerten aus der Liquoranalyse eine akute bakterielle Meningitis von anderen, nicht ambulanten Ursachen mit recht hoher Sensitivität unterscheiden [3].

Eine nosokomiale Meningitis kann auftreten, wenn chirurgische Eingriffe am Gehirn durch eine Infektion kompliziert werden [2]. Aufgrund der zugrunde liegenden ZNS-Krankheitsprozesse und ZNS-Vorrichtungen in situ unterscheiden sich die Haupterreger der nosokomialen bakteriellen Meningitis von den Erregern der ambulant erworbenen Meningitis. Das CSF-Leukozytenprofil wird durch intrazerebrale Blutungen beeinflusst, und das CSF-Laktat kann aufgrund von Ischämie erhöht sein. Darüber hinaus kann ein verändertes Bewusstsein die Diagnosestellung bei Beatmungspatienten erschweren, die nach neurochirurgischen Eingriffen Fieber entwickeln.

Der Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wird von mesenchymalen Zellen während einer Organverletzung produziert. Es wird als einkettiges Vorläuferprotein produziert und an der Verletzungsstelle durch proteolytische Spaltung aktiviert, was zu einer doppelkettigen aktiven Form von HGF führt [4]. Aktives HGF stimuliert die Zellteilung [4] und die Zellmotilität und fördert die normale morphogenetische Struktur [5] in Epithelzellen neben verletzten Bereichen. Somit induziert HGF die Regeneration und Reparatur von beschädigtem Gewebe [6]. Hohe Konzentrationen an systemischem HGF wurden bei durch Infektionen verursachten Verletzungen nachgewiesen [7]. Bei bakterieller Meningitis, Pneumonie und akuter bakterieller Gastroenteritis kommt es zu einer lokalen Produktion von HGF am Ort der Infektion [7-9]. HGF, das während einer bakteriellen Infektion lokal produziert wird, ist biologisch aktiv [10]. Die Anwendung von biologisch aktivem HGF förderte in einer Pilotstudie die Heilung von chronischen Beingeschwüren [11]. Eine wirksame Antibiotikatherapie reduziert die systemischen HGF-Spiegel während der Infektion [12-13]. HGF könnte als lokales Akute-Phase-Protein mit heilenden Eigenschaften angesehen werden [14].

Die Qualität der endogenen HGF-Bindung an Rezeptoren kann mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) bewertet werden, einer optischen Technik, die für klinische Studien geeignet ist und die Affinität eines Proteins für mehrere Liganden bestimmen kann [15]. Die SPR-basierte Bewertung der HGF-Bindungsaffinität für seine Rezeptoren, c-Met und Heparansulfat-Proteoglycan (HSPG), konnte HGF-Varianten mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten schnell und empfindlich unterscheiden [16-17].

Wir haben zuvor die Konzentration von HGF im Liquor bei Patienten mit ambulant erworbener Meningitis untersucht [7]. Wir haben auch gezeigt, dass das Vorhandensein von biologisch aktivem HGF an der Verletzungsstelle auf eine akute lokale Entzündung hinweist [18]. Während einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir bewertet, ob HGF-Konzentrationen und HGF-Bindungsaffinität für seine Rezeptoren als Marker dienen könnten, um zwischen Meningitis im Zusammenhang mit Neurochirurgie und anderen Infektionsursachen zu unterscheiden. Wir bestimmten die Konzentration und Bindungsaffinität von HGF bei Patienten mit entweder ambulant erworbener Meningitis oder mit Neurochirurgie assoziierter Meningitis und verglichen die Ergebnisse entweder mit Patienten mit Alzheimer-Krankheit oder Kontrollen mit normalem CSF. Wir haben gezeigt, dass die Bestimmung von HGF im Liquor als Indikator, ergänzend zum klinischen Status und routinemäßigen Laborbefunden, zur Diagnose einer bakteriellen Invasion in den Liquor in einem frühen Krankheitsstadium verwendet werden könnte [18].

Das Problem:

Fallbericht: Eine 76-jährige Frau mit hohem Blutdruck wurde am 28. Oktober 2009 von ihren Nachbarn bewusstlos in ihrem Garten gefunden. Der CT-Scan zeigte eine Subarachnoidalblutung und die Neuroangiographie zeigte 3 Aneurysmen. Sie wurde in die Abteilung für Neurochirurgie aufgenommen und am 29. Oktober mit Ventrikeldrainage und endovaskulärem Verschluss der Aneurysmen operiert. Sie wurde nach der Operation extubiert, litt jedoch unter Lähmung des linken Arms und Beins und Müdigkeit. Seit dem 30. Oktober hatte sie leichtes Fieber und leicht erhöhtes CRP und Procalcitonin. Liquor cerebrospinalis zeigte 170.000 rote und 630 weiße Blutkörperchen und Laktat 5,8. Das Röntgenbild des Brustkorbs zeigte eine verdächtige Infiltration. Das Blut und die Liquorkulturen wurden sichergestellt. Die am 5. November entnommenen Kulturen zeigten ein signifikantes Wachstum von Enterobacter cloacae und Staphylococcus aurous im Urin und Wachstum von Staphylococcus aurous im Nasopharynx. Sie erhielt keine Antibiotikatherapie und die Parameter nahmen spontan ab, aber das leichte Fieber hielt an. Die Liquorblutkörperchen stiegen auf 23000 rote und 106 weiße Blutkörperchen (11. November) und das Liquorlaktat betrug 4,5 (Lumbaldrainage). Obwohl CRP im Normbereich war, erhielt sie Meropenen 2 g x 3 unter Verdacht auf bakterielle Meningitis. Erst am 19. November zeigten die am 11. November entnommenen Liquorkulturen das Wachstum von Propionibacterium acnes. Die Antibiotikakur dauerte bis zum 23. November. Sie litt unter Orientierungslosigkeit, Müdigkeit und hatte einen Hydrozephalus. Sie wurde am 23. November einer Shunt-Operation unterzogen. Sie starb am 2. Dezember 2009. Bereits am 2. November wurde in der Liquoranalyse eine hohe HGF-Konzentration und eine erhöhte Bindungsaffinität zu HSPG festgestellt.

Aufgrund der Herausforderungen bei der Diagnosestellung und des Fehlens von Goldstandards sind Ärzte motiviert, Verdachtsfälle individuell zu behandeln, da es keine diagnostische Methode gibt, die den Infektionsherd rechtzeitig erkennen kann. Die PCR zum Bakterienpanel- und Virusnachweis im Liquor ist eine empfindliche Methode. Es kann jedoch auch die kolonisierten Bakterien erkennen. Das Vorhandensein von Bakterien ist nicht dasselbe wie eine Infektion. Daher können wir uns in Fällen von bakterieller Meningitis, insbesondere nach Gehirnoperationen und Fremdkörpern, die in das Gehirn eingeführt werden, nicht vollständig auf positive oder negative Kulturen verlassen. Eine komplementäre Methode (zu den im Labor verfügbaren Standardmethoden) mit hohem negativem Vorhersagewert erhöht die Spezifität der Tests und senkt die Kosten, den Zeitaufwand und Komplikationen wie im Krankenhaus erworbene Infektionen (HAI) erheblich.

Die Methode, Reverse Metachromacy:

Der N-Terminus von HGF (Hairpin Loop) wurde als Bindungsstelle sowohl für c-Met als auch für HSPG identifiziert. Es besteht eine hohe Korrelation zwischen der Bindung von HGF an HSPG und an Dextransulfat im SPR-System (Fig. 1). Metochromasie ist eine charakteristische Farbveränderung, die bestimmte Anilinfarbstoffe zeigen, wenn sie an chromotrope Substanzen gebunden sind [19]. Dieses Phänomen wurde häufig bei der Untersuchung von Gewebeschnitten verwendet. Methylenblau (O-Toluidin) gilt als ausgezeichneter metachromatischer Farbstoff. Bei Bindung an hochmolekulare Polysaccharide wie Dextransulfat ändert sich die Farbe der Indikatorlösung von blau nach rot [19].

Kombinationen von Dextransulfat und O-Toluidin in unterschiedlichen Anteilen ergeben purpurrot gefärbte Lösungen unterschiedlicher Intensität. Beschichtete kundenspezifische Filterpapiere bilden Oberflächen, die auf Streifen gelegt werden. Bei Kontakt mit biologischen Lösungen ersetzt der Proben-HGF kompetitiv O-Toluidin für die Bindung an Dextransulfat und die Farbe der Oberfläche kehrt zu Blau zurück (Fig. 2). Diese Plattform erkennt das Vorhandensein von HSPG-bindenden Proteinen wie HGF in Körperflüssigkeiten, einschließlich Expektorans, Urin, Geschwürsekreten, Liquor cerebrospinalis und Gelenkergüssen während einer Infektion. Hohe Proteinmengen oder ein hoher pH-Wert verursachen bei diesem Gerät keine unspezifischen Reaktionen.

Der Studienplan:

Studienleiter: Amir Ramezani

Das Verfahren:

Liquorproben, Urin und Sputum (n=500) werden von Patienten (1-99 Jahre alt) gesammelt, die sich einer Hirntumoroperation, intrazerebralen Blutung, Shunt-Dysfunktion oder Schädelfraktur unterzogen haben. Die Proben werden bis zur Durchführung der Analysen bei -20 °C gefroren aufbewahrt. Es gibt keine Ausschlusskriterien.

Kontrolliert die Alzheimer-Krankheit (n=20)

• Von Patienten (N=20), bei denen in der Memory Clinic, Skåne University Hospital in Malmö, Alzheimer diagnostiziert wurde, wurden Liquorproben entnommen und eingefroren. Die überarbeiteten DSM-III- und NINDS-ADRDA-Kriterien wurden für die Diagnose der Alzheimer-Demenz verwendet (diese Studiengruppe wurde in eine frühere Studie eingeschlossen).
• Normaler Liquor
• Diese Gruppe besteht aus Patienten, die sich einer Lumbalpunktion unterzogen haben, um eine Meningitis auszuschließen, und die einen normalen Liquor hatten.
• Analyse der Ligandenbindungsaffinität mit Oberflächenplasmonresonanz
• Die biologische Aktivität von HGF wird mit SPR analysiert. Wir messen die Bindungsaffinität zu HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und zu einer rekombinanten c-Met-Chimäre (R&D Systems), wie zuvor beschrieben.
• Messungen der HGF-Konzentrationen in Proben Ein spezifischer ELISA-Kit (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Quantikine Human HGF Immunoassay, minimale Nachweisgrenze: 0,04 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) wurde verwendet, um die HGF-Konzentrationen im Liquor zu bestimmen. Sputum und Urin nach Herstellerangaben. Alle Messungen wurden mit einem ELISA-Lesegerät (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Österreich) bei 450 nm durchgeführt, das mit den rekombinanten humanen HGF-Referenzproben und den im Kit bereitgestellten Standards kalibriert wurde.
• Reverse Methachromacy Der Studienstreifentest wird an allen Proben durchgeführt.
• Routinemäßige Laboruntersuchungen
• Liquor wird analysiert, um Parameterwerte an den Abteilungen für Klinische Chemie der Universitätskliniken in Linköping zu bestimmen. Alle Kulturen, PCR-Assays, Antigen-Nachweisassays und serologischen Bewertungen werden in der Abteilung für Mikrobiologie, Universitätsklinikum, Linköping, Schweden, durchgeführt.
• CSF-Zellen: Durchgeführt durch manuelle Phasenkontrastmikroskopie (Zeiss) unter Verwendung der Jessen-Kammer zum Zählen der Anzahl von Erythrozyten und Leukozyten (polymorphkernige Neutrophile und Monozyten).
• CSF-Laktat: Durchgeführt mit dem Benchtop-Blutgasanalysator ABL 800 (Radiometer Medical ApS Dänemark).
• Antigen-Nachweis: Antigen (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides Gruppe A, Gruppe B/Escherichia coli K1, Gruppe C und Gruppe Y/135, Streptococcus agalactiae) wird durch die Latex-Agglutinationsmethode Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Frankreich) nachgewiesen .
• CSF-Kultur: Durchgeführt in aeroben und anaeroben Flaschen sowie in Hämatinplatten.
• Virusnachweis PCR: Herpesvirus Typ 1 und 2 (HSV1, HSV 2) und HZV-DNA wurden mittels PCR nachgewiesen. Humanes Enterovirus (HEV) wurde durch ein automatisiertes Instrument (Cepheid GeneXpert) analysiert.
• statistische Analyse
• Da die HGF-Konzentrationen und Bindungsaffinitätsdaten nicht normalverteilt sind, sind nichtparametrische Tests Kruskal-Wallis-Test, gefolgt vom Mann-Whitney-U-Test oder dem Wilcoxon-Matching-Pairs-Test für die Analyse geeignet. Die Analyse der Testleistung muss manuell durchgeführt werden.

Klinische Bewertung der Plattform in einem dextransulfathaltigen Gel Unter Verwendung des Reverse-Methachromacy-Ansatzes haben wir insgesamt 656 Kotproben untersucht, wobei die Sensitivität, Spezifität, der positive Vorhersagewert und der negative Vorhersagewert sowie die Genauigkeit in den folgenden Gruppen berechnet wurden : nachgewiesene infektiöse Gastroenteritis (n=207) und andere Ursachen von Durchfall, einschließlich CED (n=268). Der Test konnte akute infektiöse Gastroenteritis mit einer Sensitivität von 96,6 % und einer Spezifität von 92,4 % sowie einem positiven Vorhersagewert von 90,9 % und einem negativen Vorhersagewert von 97,2 % unterscheiden. Die Genauigkeit des Tests betrug 94,3 %. Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen den Testergebnissen und Calprotectin im Stuhl gefunden (R2=0,056). Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen den Ergebnissen des Indextests und dem Vorhandensein von Blut im Stuhl beobachtet (R2=0,08) [20].

Klinische Bewertung von HGF als Marker zur Unterscheidung der septischen Meningitis von anderen Ursachen der Pleozytose [18] Die ambulant erworbene septische Meningitis zeigte eine signifikant höhere HGF-Konzentration (p = 0,0133) sowie eine HGF-Bindungsaffinität zu den c-Met- und HSPG-Rezeptoren (p = 0,0007 bzw. p = 0,0009) im Vergleich zu nosokomialer Meningitis. CSF-Proben von Patienten mit septischer Meningitis (einschließlich ambulant erworbener und nosokomialer) waren signifikant höher in HGF-Konzentrationen (p = 0,0014), HGF-Bindung an HSPG (p < 0,0001) und HGF-Bindung an c-Met (p < 0,0001) verglichen mit Proben von Patienten mit aseptischer (viraler und subakuter) Meningitis. Liquorproben von Patienten mit septischer Meningitis waren in der HGF-Konzentration höher als Proben aus der Kontrollgruppe (Patienten mit normalem Liquor) und von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (p < 0,0001, p = 0,0010), HGF-Bindung an HSPG (p < 0,0001 bzw. p = 0,9) und HGF-Bindung an c-Met (beide p < 0,0001).

Im Vergleich zu Proben von Patienten, die sich einer Neurochirurgie unterzogen hatten und an anderen Infektionskrankheiten litten, wiesen Liquorproben von Patienten mit nosokomialer Meningitis signifikant höhere HGF-Konzentrationen (p < 0,0001) und HGF-Bindungsaffinität zu c-Met (p < 0,0001) und HSPG (p = 0,0001) auf 0,043) Rezeptoren (Abbildung 3-4).

Abbildungslegenden Abb. 1. Sequenz eines Teils der HGF-α-Kette. Die vergrößerten Codons kodieren für Aminosäuren, die für die Bindung an HSPG und den c-Met-Rezeptor wichtig sind.

Abb. 2. Die theoretische Unterstützung für den zweiten Ansatz für ein Gerät zum Nachweis des Vorhandenseins von HGF in Körperflüssigkeiten während einer Infektion. (1) Glucosaminoglycan (GAG)-Polymerkette mit negativen Ladungen. (2) Positive TBO-Moleküle heften sich an die Polymerkette, werden dann konzentriert und bilden Stapel. Die Farbe ändert sich von blau nach rot. (3) Eine Probe mit HGF wird hinzugefügt, die an GAG bindet. (4) TBO-Molekülstapel werden zerstört und werden zu frei gelösten TBO-Molekülen. Die Farbe ändert sich von rot nach blau.

Abbildung 3: Flussdiagramm der Auswahl von Liquorproben aus Patienten- und Kontrollgruppen. Extraproben sind die Proben, die während des stationären Aufenthalts von Patienten mit nosokomialer Meningitis entnommen werden.

Abbildung 4: Die Eigenschaften von HGF, das aus verschiedenen CSF-Proben stammt, wurden unter Verwendung von Oberflächenplasmon- und ELISA-Techniken analysiert. (A) Bindung an c-Met-Rezeptoren; (B) Bindung an HSPG-Rezeptoren; (C) HGF-Konzentrationen (Median). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

Die rasche Entwicklung und Verbreitung antimikrobiell resistenter Bakterien bei gleichzeitig unzureichender Entwicklung neuer Wirkstoffe beeinträchtigt die zukünftige antiinfektiöse Therapie bakterieller Infektionen, insbesondere derjenigen, die durch gramnegative Stäbchen verursacht werden. Experten auf diesem Gebiet schätzen, dass die Welt im nächsten Jahrzehnt die weite Verbreitung nicht behandelbarer (oder nahezu unbehandelbarer) Infektionen sowohl innerhalb als auch außerhalb von Krankenhäusern erleben wird. Um diese Krise zu vermeiden oder zumindest zu versuchen, sie hinauszuzögern, haben sich viele Forscher der Aufklärung der Faktoren gewidmet, die das Auftreten und die weltweite Ausbreitung antimikrobiell resistenter Bakterien begünstigen. Eine wirksame Strategie zur Begrenzung des Auftretens mehrfach resistenter Stämme könnte die Lenkung der Antibiotikatherapie umfassen, indem Fälle identifiziert werden, die mit Antibiotika behandelt werden sollten oder nicht, die Verabreichung von Breitbandantibiotika vermieden und spezifischere Behandlungen gefördert werden.

Was benötigt wird, ist ein einfacher, genauer, kostengünstiger und durchführbarer Test, der Antworten auf entscheidende Fragen liefert.

Um die klinische Relevanz und Leistung eines solchen Tests zu beurteilen, gibt es kein besseres Umfeld als das schwedische Gesundheitswesen, das für fast alle Patienten eine relevante und moderne Beurteilung von Krankheiten und eine evidenzbasierte Therapie bietet. Eine solche Umgebung ist eine Gelegenheit, den Patienteneinschluss und die Bewertung des Studientests im Vergleich zu den zuverlässigsten Standardinstrumenten wie Kulturen, Bluttests und Röntgenaufnahmen durchzuführen. Diese Ressourcen sind in keinem anderen Zentrum mit solch zuverlässigen, nichtkommerziellen und unparteiischen Eigenschaften automatisch verfügbar.

dnr 2015-429-32