Hurtig test til påvisning af infektionsfokus hos postneurokirurgiske patienter.

Hepatocytvækstfaktor (HGF) er lokalt akut faseprotein med regenerative egenskaber, der bliver biologisk inaktivt under kronisk inflammation og mister bindingsaffiniteten til glycosaminoglycan i den ekstracellulære matrix. HGF udskilles i mave-tarmkanalen og påvises ikke i normal urin. Nosokomiel meningitis kan opstå, når hjernekirurgiske procedurer kompliceres af infektion. På grund af underliggende CNS-sygdomsprocesser og CNS-anordninger in situ, adskiller de vigtigste midler af nosokomiel bakteriel meningitis sig fra midlerne til samfundserhvervet meningitis. For eksempel ved nosokomiale infektioner er langsomt voksende opportunistiske mikroorganismer dominerende. CSF-leukocytprofilen påvirkes af intracerebral blødning, og CSF-lactat kan være forhøjet på grund af iskæmi. Ændret bevidsthed kan desuden gøre det vanskeligt at stille en diagnose hos patienter i respirator, som udvikler feber efter neurokirurgiske operationer. Det er med andre ord ofte svært at afgøre, om den skadede hjerne er blevet invaderet af miljøets bakterieflora.

På grund af udfordringerne med at stille en diagnose og manglen på guldstandarder er læger motiverede til at behandle formodede infektioner ved alvorlige sygdomme med bredspektrede antibiotika. De nye problemer med multiresistensbakterier, høje omkostninger og komplikationer i forbindelse med nye antibiotika har krævet diagnostiske tests, der kan minimere antibiotikaforbruget.

I øjeblikket forbliver diagnosen af ​​bakteriel meningitis baseret på standardmetoder til direkte mikroskopi, differentielle analyser af hvide blodlegemer, laktat og protein og kulturer af blod og CSF. Imidlertid er post-neurokirurgiske infektioner svære at skelne fra virkningerne af neurokirurgiske procedurer. På grund af profylaksebehandlinger er kulturerne desuden negative i en stor gruppe patienter, og tilstedeværelsen af ​​hudflora, som Coagulase negative Staphylococcus eller Propionbacterium acnes, kan indikere enten infektion eller kontaminering. Overlevelse fra denne livstruende tilstand afhænger af en hurtig diagnose og hurtig empirisk antibiotikabehandling designet til at dække de sandsynlige patogener.

Hvor er fokus for infektion? Er det en bakteriel (septisk) meningitis? Er bredspektret antibiotikaadministration indiceret? Baggrunden for projektet: En invasion af bakterier i centralnervesystemet (CNS) efterfølges af en hurtigt udviklende inflammatorisk proces, der påvirker arachnoidrummet, pia mater og cerebrospinalvæsken (CSF). Denne tilstand fører til kliniske symptomer på hovedpine, feber og meningisme. Den inflammatoriske reaktion er forårsaget af frigivelsen af ​​forskellige pro-inflammatoriske cytokiner fra meningealceller til det subarachnoidale rum. Som et resultat bevæger neutrofiler sig ind i det subarachnoidale rum og forårsager pleocytose i CSF. Konsekvenserne omfatter nedbrydning af blod-hjerne-barrieren, cerebralt ødem, nedsat cerebral blodgennemstrømning, fokale områder med hypoperfusion, vaskulær trombose, iskæmi, øget glukosemetabolisme via den anaerobe glykolytiske vej og øget laktatakkumulering i hjernen og CSF [ 1]. Overlevelse fra denne livstruende tilstand afhænger af en hurtig diagnose og hurtig empirisk antibiotikabehandling designet til at dække de sandsynlige patogener.

Andre årsager til febril meningitis omfatter akut viral meningitis og ikke-pyogen meningitis, hvor det kliniske billede typisk er subakut eller kronisk. De diagnostiske procedurer består af en lumbalpunktur for at analysere CSF for celler og bakterier, mikrobiologiske kulturer af blod og CSF, serologiske tests, der involverer PCR og antigen-detektion, og radiografiske teknikker [2]. Ved samfundserhvervet meningitis kan en kombination af diskriminerende værdier fra CSF-analysen differentiere akut bakteriel meningitis fra andre, ikke-ambulatoriske årsager med ret høj følsomhed [3].

Nosokomiel meningitis kan forekomme, når hjernekirurgiske procedurer kompliceres af infektion [2]. På grund af underliggende CNS-sygdomsprocesser og CNS-anordninger in situ, adskiller de vigtigste midler af nosokomiel bakteriel meningitis sig fra midlerne til samfundserhvervet meningitis. CSF-leukocytprofilen påvirkes af intracerebral blødning, og CSF-lactat kan være forhøjet på grund af iskæmi. Ændret bevidsthed kan desuden gøre det vanskeligt at stille en diagnose hos patienter i respirator, som udvikler feber efter neurokirurgiske operationer.

Hepatocytvækstfaktor (HGF) produceres af mesenkymale celler under organskade. Det produceres som et enkeltkædet precursorprotein, og det aktiveres på skadestedet ved proteolysespaltning, hvilket resulterer i en dobbeltkædet aktiv form af HGF [4]. Aktiv HGF stimulerer celledeling [4] og cellemotilitet, og det fremmer normal morfogen struktur [5] i epitelceller, der støder op til skadede områder. HGF inducerer således regenerering og genparring af beskadiget væv [6]. Høje niveauer af systemisk HGF er blevet påvist under skader forårsaget af infektion [7]. Ved bakteriel meningitis, pneumoni og akut bakteriel gastroenteritis er der lokal produktion af HGF på infektionsstedet [7-9]. HGF produceret lokalt under bakteriel infektion er biologisk aktiv [10]. Anvendelse af biologisk aktiv HGF fremmede heling af kroniske bensår i en pilotundersøgelse [11]. Effektiv antibiotikabehandling reducerer systemiske HGF-niveauer under infektion [12-13]. HGF kan betragtes som et lokalt akut faseprotein med helbredende egenskaber [14].

Kvaliteten af ​​endogen HGF-binding til receptorer kan vurderes med overfladeplasmonresonans (SPR), en optisk teknik, der er egnet til kliniske undersøgelser, der kan bestemme affiniteten af ​​et protein for flere ligander [15]. SPR-baseret vurdering af HGF-bindingsaffinitet for dets receptorer, c-Met og heparansulfatproteoglycan (HSPG), kunne hurtigt og følsomt skelne mellem HGF-varianter med forskellige biologiske aktiviteter [16-17].

Vi har tidligere undersøgt koncentrationen af ​​HGF i CSF for patienter med samfundserhvervet meningitis [7]. Vi har også vist, at tilstedeværelsen af ​​biologisk aktiv HGF på skadestedet indikerer en akut lokal inflammation [18]. Under en nylig undersøgelse har vi vurderet, om HGF-koncentrationer og HGF-bindingsaffinitet for dets receptorer kan tjene som markører til at skelne mellem meningitis forbundet med neurokirurgi og andre årsager til infektion. Vi bestemte koncentrationen og bindingsaffiniteten af ​​HGF i patienter med enten samfundserhvervet meningitis eller neurokirurgi-associeret meningitis og sammenlignede resultaterne med enten patienter med Alzheimers sygdom eller kontroller med normal CSF. Vi har vist, at bestemmelse af HGF i CSF kan bruges som en indikator, komplementær til klinisk status og rutinemæssige laboratoriefund, til diagnosticering af bakteriel invasion i CSF på et tidligt stadium af sygdom [18].

Problemet:

Caserapport: 76 år gammel kvinde med forhøjet blodtryk blev fundet af sine naboer bevidstløs i sin have den 28. oktober 2009. CT-scanningen afslørede subaraknoidal blødning, og neuro-angiografi afslørede 3 aneurismer. Hun blev indlagt på neurokirurgisk afdeling og opereret 29. oktober med ventrikulær drænage og endovaskulær okklusion af aneurismerne. Hun blev ekstuberet efter operationen, men hun led af lammelser i venstre arm og ben og træthed. Siden den 30. oktober havde hun lav feber og lidt øget CRP og procalcitonin. Cerebrospinalvæske viste 170.000 røde og 630 hvide blodlegemer og laktat 5,8. Røntgenbilledet af thorax viste en mistænkt infiltration. Blod- og CSF-kulturerne blev sikret. Kulturerne taget fra 5. november afslørede betydelig vækst af Enterobacter cloacae og Staphylococcus aurous i urin og vækst af Staphylococcus aurous i nasopharynx. Hun modtog ingen antibiotikabehandling, og parametrene faldt spontant, men lav feber fortsatte. CSF-blodcellerne steg til 23.000 røde og 106 hvide blodlegemer (11. november), og CSF-lactat var 4,5 (lumbal dræning). Selvom CRP var i normalområdet fik hun meropenen 2g x 3 under mistanke om bakteriel meningitis. Først den 19. november afslørede CSF-kulturerne taget den 11. november vækst af Propionibacterium acnes. Antibiotikaregimet fortsatte indtil den 23. november. Hun led af desorientering, træthed og havde hydrocephalus. Hun gennemgik en shuntoperation den 23. november. Hun døde den 2. december 2009. Høj koncentration af HGF og forhøjet bindingsaffinitet til HSPG blev fundet i CSF-analyse allerede den 2. november.

På grund af udfordringerne med at stille en diagnose, og manglen på guldstandarder, er læger motiverede til at behandle formodede infektioner individuelt, fordi der ikke findes en diagnostisk metode, der kan identificere infektionsfokus i tide. PCR til bakteriepanel og virusdetektion i CSF er følsom metode. Men det kan også opdage de koloniserede bakterier. Tilstedeværelsen af ​​bakterier er ikke det samme som infektion. Derfor kan vi i tilfælde af bakteriel meningitis, især efter hjernekirurgi og de fremmedlegemer, der indsættes i hjernen, ikke stole på positive eller negative kulturer totalt. En komplementær metode (til standardmetoder, der er tilgængelige i laboratoriet) med høj negativ prædiktiv værdi øger specificiteten af ​​tests og reducerer omkostningerne, tiden og komplikationerne såsom hospitalserhvervede infektioner (HAI) markant.

Metoden, omvendt metachromati:

N-terminalen af ​​HGF (Hairpin Loop) er blevet identificeret som bindingsstedet til både c-Met og HSPG. Der er en høj korrelation mellem binding af HGF til HSPG og til dextransulfat i SPR-systemet (fig. 1). Metokromasi er en karakteristisk farveændring, som visse anilinfarvestoffer udviser, når de bindes til kromotrope stoffer [19]. Dette fænomen har været meget brugt i studiet af vævssnit. Methylenblåt (O-toluidin) betragtes som et fremragende metakromatisk farvestof. Ved binding til højmolekylære polysaccharider, såsom dextransulfat, ændres farven på indikatoropløsningen fra blå til rød [19].

Kombinationer af dextransulfat og O-toluidin i forskellige proportioner producerer lilla-rød farvede opløsninger af varierende intensitet. Coated tilpasset filterpapir udgør overflader, der placeres på strimler. Når den er i kontakt med biologiske opløsninger, erstatter prøven HGF kompetitivt O-toluidin til binding til dextransulfat, og farven på overfladen vender tilbage til blå (fig. 2). Denne platform detekterer tilstedeværelsen af ​​HSPG-bindende proteiner såsom HGF i kropsvæsker, herunder slimløsende, urin, mavesekretioner, cerebrospinalvæske og ledeffusion under infektion. Høje mængder protein eller høj pH forårsager ikke uspecifikke reaktioner med denne enhed.

Studieplanen:

Studieleder: Amir Ramezani

Proceduren:

CSF-prøver, urin og sputum (n=500) indsamles fra patienter (1-99 år gamle), der har gennemgået hjernetumorkirurgi, intracerebral blødning, shuntdysfunktion eller kraniebrud. Prøverne opbevares frosset ved -20°C, indtil analyser blev udført. Der er ingen udelukkelseskriterier.

Styrer Alzheimers sygdom (n=20)

• CSF-prøver blev indsamlet og opbevaret frosset fra patienter (N=20), der blev diagnosticeret med Alzheimers sygdom på Memory Clinic, Skånes Universitetshospital i Malmø. De reviderede DSM-III og NINDS-ADRDA kriterier blev brugt til diagnosticering af Alzheimers demens (denne undersøgelsesgruppe er blevet inkluderet i tidligere undersøgelse).
• Normal CSF
• Denne gruppe består af patienter, der har gennemgået lumbalpunktur for at udelukke meningitis, og de havde normal CSF.
• Analyse af ligandbindingsaffinitet med overfladeplasmonresonans
• Den biologiske aktivitet af HGF analyseres med SPR. Vi måler bindingsaffiniteten til HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og til en c-Met rekombinant kimær (R&D Systems), som tidligere beskrevet.
• Målinger af HGF-koncentrationer i prøver Et specifikt enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Quantikine Human HGF immunoassay, minimum påviselig grænse: 0,04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) blev brugt til at bestemme HGF-koncentrationer i CSF, sputum og urin i henhold til producentens anvisninger. Alle målinger blev udført med en ELISA-læser (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Østrig) ved 450 nm, som blev kalibreret med de rekombinante humane HGF-referenceprøver og standarderne i sættet.
• Omvendt methakromati Studiestrimmeltesten udføres på alle prøver.
• Rutinemæssig laboratorievurdering
• CSF analyseres for at bestemme parameterværdier på afdelingerne for klinisk kemi, universitetshospitalerne i Linköping. Alle kulturer, PCR-assays, antigendetektionsassays og serologiske vurderinger udføres på Mikrobiologiafdelingen, Universitetshospitalet, Linköping, Sverige.
• CSF-celler: Udføres ved manuel fasekontrastmikroskopi (Zeiss) med Jessen Chamber til at tælle antallet af erytrocytter og leukocytter (polymorfonukleære neutrofiler og monocytter).
• CSF-laktat: Udføres ved hjælp af benchtop blodgasanalysator ABL 800 (Radiometer Medical ApS Danmark).
• Antigenpåvisning: Antigen (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides gruppe A, gruppe B/Escherichia coli K1, gruppe C og gruppe Y/135, Streptococcus agalactiae) påvises ved latexagglutinationsmetoden Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Frankrig) .
• CSF-kultur: Udføres i aerobe og anaerobe kolber samt i hæmatinplader.
• Virusdetektion PCR: Herpesvirus type 1 og 2 (HSV1, HSV 2) og HZV DNA blev påvist ved PCR. Human enterovirus (HEV) blev analyseret med automatiseret instrument (Cepheid GeneXpert).
• Statistisk analyse
• Fordi HGF-koncentrationerne og bindingsaffinitetsdata ikke er normalfordelte, er ikke-parametriske tests Kruskal-Wallis-test efterfulgt af Mann-Whitney U-testen eller Wilcoxon matchede par-testen passende til analyse. Analysen af ​​prøvningsydelsen skal udføres manuelt.

Klinisk evaluering af platformen i en dextransulfatholdig gel Ved at bruge omvendt methachromacy-tilgang har vi undersøgt i alt 656 fæcesprøver med sensitivitet, specificitet, positiv prædiktiv værdi og negativ prædiktiv værdi samt nøjagtigheden blev beregnet i følgende grupper : verificeret infektiøs gastroenteritis (n=207) og andre årsager til diarré, herunder IBD (n=268). Testen kunne skelne akut infektiøs gastroenteritis med en sensitivitet på 96,6 % og specificitet 92,4 % og en positiv prædiktiv værdi på 90,9 % og negativ prædiktiv værdi på 97,2 %. Testnøjagtigheden var 94,3%. Der blev ikke fundet nogen signifikant sammenhæng mellem testresultaterne og fæces calprotectin (R2=0·056). Der blev ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem resultaterne af indekstesten og tilstedeværelsen af ​​blod i fæces (R2=0·08) [20].

Klinisk evaluering af HGF som en markør til at skelne septisk meningitis fra andre årsager til pleocytose [18] Den samfundserhvervede septiske meningitis viste signifikant højere HGF-koncentration (p=0,0133), såvel som HGF-bindingsaffinitet til c-Met- og HSPG-receptorerne (p=0,0007 og p=0,0009, henholdsvis) sammenlignet med nosokomiel meningitis. CSF-prøver fra patienter med septisk meningitis (herunder både samfundserhvervet og nosokomial) var signifikant højere i HGF-koncentrationer (p=0,0014), HGF-binding til HSPG (p<0,0001) og HGF-binding til c-Met (p<0,0001) sammenlignet med prøver fra patienter med aseptisk (viral og subakut) meningitis. CSF-prøver fra patienter med septisk meningitis var højere fra prøver fra kontrolgruppen (patienter med normal CSF) og fra patienter med Alzheimers sygdom i HGF-koncentration (p<0,0001, hhv. p=0,0010), HGF-binding til HSPG (henholdsvis p<0,0001 og p=0,9) og HGF-binding til c-Met (begge p<0,0001).

Sammenlignet med prøver fra patienter, der havde gennemgået neurokirurgi og havde andre infektionssygdomme, havde CSF-prøver fra patienter med nosokomiel meningitis signifikant højere HGF-koncentrationer (p<0,0001) og HGF-bindingsaffinitet til c-Met (p<0,0001) og HSPG (p= 0,043) receptorer (figur 3-4).

Figurforklaringer Fig. 1. Sekvens af en del af HGF a-kæden. De forstørrede kodoner koder for aminosyrer, der er vigtige for binding til HSPG og c-Met-receptoren.

Fig. 2. Den teoretiske støtte for den anden tilgang til en anordning til at detektere tilstedeværelsen af ​​HGF i kropsvæsker under en infektion. (1) Glucosaminoglycan (GAG) polymerkæde med negative ladninger. (2) Positive TBO-molekyler binder sig til polymerkæden og koncentreres derefter og danner stakke. Farven skifter fra blå til rød. (3) En prøve med HGF tilsættes, som binder til GAG. (4) TBO-molekylestakke ødelægges og bliver til frit opløste TBO-molekyler. Farven skifter fra rød til blå.

Figur 3: Flowdiagram over udvælgelsen af ​​CSF-prøver fra patient- og kontrolgrupper. Ekstra prøver er de prøver, der tages under ophold på afdelingen fra patienter med nosokomiel meningitis.

Figur 4: Egenskaber af HGF afledt af forskellige CSF-prøver blev analyseret ved anvendelse af overfladeplasmon- og ELISA-teknikker. (A) Binding til c-Met-receptorer; (B) Binding til HSPG-receptorer; (C) HGF-koncentrationer (median). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

Den hurtige udvikling og spredning af antimikrobielle resistente bakterier parallelt med utilstrækkelig udvikling af nye aktive lægemidler påvirker alvorligt fremtidig anti-infektionsbehandling af bakterielle infektioner, især dem, der skyldes gramnegative stave. Eksperter på området vurderer, at verden i det næste årti vil have været vidne til den brede udbredelse af infektioner, der ikke kan behandles (eller næsten ikke behandles), både inden for og uden for hospitaler. For at undgå eller i det mindste forsøge at forsinke denne krise har mange forskere dedikeret deres indsats til at belyse faktorer, der fremmer fremkomsten og den globale spredning af antimikrobielle resistente bakterier. En effektiv strategi til at begrænse fremkomsten af ​​flere resistente stammer kan omfatte styring af antibiotikabehandlingen ved at identificere tilfælde, der bør eller ikke bør behandles med antibiotika, undgå bredspektret antibiotikaadministration og fremme mere specifikke behandlinger.

Det, der er brug for, er en enkel, præcis, omkostningseffektiv og gennemførlig test, der besvarer afgørende spørgsmål.

For at vurdere den kliniske relevans og udførelsen af ​​en sådan test er der ikke et bedre miljø end det svenske sundhedsvæsen, der giver den relevante og moderne vurdering af sygdomme og evidensbaseret terapi for næsten alle patienter. Et sådant miljø er en mulighed for at udføre patientinklusionen og evalueringen af ​​undersøgelsestesten i sammenligning med de mest pålidelige standardværktøjer såsom kulturer, blodprøver og røntgenbilleder. Disse ressourcer er ikke automatisk tilgængelige i noget andet center med sådanne pålidelige, ikke-kommercielle og upartiske egenskaber.

dnr 2015-429-32