Sneltest voor detectie van de focus van infectie bij post-neurochirurgische patiënten.

Hepatocytengroeifactor (HGF) is een lokaal acuut fase-eiwit met regeneratieve eigenschappen dat tijdens chronische ontsteking biologisch inactief wordt en de bindingsaffiniteit met glycosaminoglycaan in de extracellulaire matrix verliest. HGF wordt uitgescheiden in het maagdarmkanaal en wordt niet gedetecteerd in normale urine. Nosocomiale meningitis kan optreden wanneer chirurgische ingrepen in de hersenen worden bemoeilijkt door een infectie. Vanwege onderliggende CZS-ziekteprocessen en CZS-apparaten in situ verschillen de belangrijkste veroorzakers van nosocomiale bacteriële meningitis van de veroorzakers van buiten het ziekenhuis opgelopen meningitis. Bij ziekenhuisinfecties bijvoorbeeld overheersen langzaam groeiende, opportunistische micro-organismen. Het CSF-leukocytenprofiel wordt beïnvloed door intracerebrale bloeding en CSF-lactaat kan verhoogd zijn als gevolg van ischemie. Bovendien kan een veranderd bewustzijn het stellen van een diagnose bemoeilijken bij patiënten aan beademingsapparaten die koorts krijgen na neurochirurgische operaties. Met andere woorden, het is vaak moeilijk om te bepalen of de beschadigde hersenen zijn binnengedrongen door bacteriële omgevingsflora.

Vanwege de uitdagingen bij het stellen van een diagnose en het ontbreken van gouden standaarden, zijn artsen gemotiveerd om vermoedelijke infecties bij ernstige ziekten te behandelen met breedspectrumantibiotica. De opkomende problemen van bacteriën met meervoudige resistentie, hoge kosten en complicaties in verband met nieuwe antibiotica hebben geleid tot diagnostische tests die het antibioticagebruik kunnen minimaliseren.

Momenteel blijft de diagnose van bacteriële meningitis gebaseerd op standaardmethoden van directe microscopie, differentiële analyses van witte bloedcellen, lactaat en eiwit, en kweken van bloed en CSF. Post-neurochirurgische infecties zijn echter moeilijk te onderscheiden van de effecten van neurochirurgische procedures. Bovendien zijn door profylaxebehandelingen de kweken bij een grote groep patiënten negatief en kan de aanwezigheid van huidflora, zoals Coagulase-negatieve Staphylococcus of Propionbacterium acnes, duiden op infectie of besmetting. Overleving van deze levensbedreigende aandoening hangt af van een snelle diagnose en snelle empirische antibiotische therapie die is ontworpen om de waarschijnlijke pathogenen te dekken.

Waar ligt de focus van infectie? Is het een bacteriële (septische) meningitis? Is de toediening van breedspectrumantibiotica geïndiceerd? De achtergrond van het project: Een invasie van bacteriën in het centrale zenuwstelsel (CZS) wordt gevolgd door een zich snel ontwikkelend ontstekingsproces dat de arachnoïde ruimte, de pia mater en de cerebrospinale vloeistof (CSF) aantast. Deze aandoening leidt tot klinische symptomen van hoofdpijn, koorts en meningisme. De ontstekingsreactie wordt veroorzaakt door het vrijkomen van verschillende pro-inflammatoire cytokines uit meningeale cellen in de subarachnoïdale ruimte. Als gevolg hiervan verplaatsen neutrofielen zich naar de subarachnoïdale ruimte en veroorzaken ze pleocytose in het CSF. De gevolgen zijn onder meer de afbraak van de bloed-hersenbarrière, cerebraal oedeem, verminderde cerebrale doorbloeding, focale gebieden van hypoperfusie, vasculaire trombose, ischemie, verbeterd glucosemetabolisme via de anaerobe glycolytische route en verhoogde lactaataccumulatie in de hersenen en CSF [ 1]. Overleving van deze levensbedreigende aandoening hangt af van een snelle diagnose en snelle empirische antibiotische therapie die is ontworpen om de waarschijnlijke pathogenen te dekken.

Andere oorzaken van febriele meningitis zijn onder meer acute virale meningitis en niet-pyogene meningitis, waarbij het klinische beeld doorgaans subacuut of chronisch is. De diagnostische procedures bestaan ​​uit een lumbale punctie om het CSF te analyseren op cellen en bacteriën, microbiologische culturen van bloed en CSF, serologische tests met PCR en antigeendetectie, en radiografische technieken [2]. Bij community-acquired meningitis kan een combinatie van discriminerende waarden uit de CSF-analyse acute bacteriële meningitis onderscheiden van andere, niet-ambulante oorzaken met een vrij hoge gevoeligheid [3].

Nosocomiale meningitis kan optreden wanneer chirurgische ingrepen in de hersenen worden bemoeilijkt door een infectie [2]. Vanwege onderliggende CZS-ziekteprocessen en CZS-apparaten in situ verschillen de belangrijkste veroorzakers van nosocomiale bacteriële meningitis van de veroorzakers van buiten het ziekenhuis opgelopen meningitis. Het CSF-leukocytenprofiel wordt beïnvloed door intracerebrale bloeding en CSF-lactaat kan verhoogd zijn als gevolg van ischemie. Bovendien kan een veranderd bewustzijn het stellen van een diagnose bemoeilijken bij patiënten aan beademingsapparaten die koorts krijgen na neurochirurgische operaties.

Hepatocytengroeifactor (HGF) wordt geproduceerd door mesenchymale cellen tijdens orgaanbeschadiging. Het wordt geproduceerd als een voorlopereiwit met een enkele keten en wordt geactiveerd op de plaats van de verwonding door proteolyse-splitsing, wat resulteert in een actieve vorm van HGF met dubbele keten [4]. Actief HGF stimuleert de celdeling [4] en celmotiliteit en bevordert de normale morfogenetische structuur [5] in epitheelcellen die grenzen aan beschadigde gebieden. Aldus induceert HGF regeneratie en herstel van beschadigd weefsel [6]. Hoge niveaus van systemische HGF zijn gedetecteerd tijdens verwondingen veroorzaakt door infectie [7]. Bij bacteriële meningitis, pneumonie en acute bacteriële gastro-enteritis is er lokale productie van HGF op de plaats van infectie [7-9]. HGF lokaal geproduceerd tijdens bacteriële infectie is biologisch actief [10]. Toepassing van biologisch actief HGF bevorderde de genezing van chronische beenulcera in een pilootstudie [11]. Effectieve antibiotische therapie verlaagt systemische HGF-spiegels tijdens infectie [12-13]. HGF zou kunnen worden beschouwd als een lokaal acuut fase-eiwit met genezende eigenschappen [14].

De kwaliteit van endogene HGF-binding aan receptoren kan worden beoordeeld met oppervlakte-plasmonresonantie (SPR), een optische techniek die geschikt is voor klinische studies die de affiniteit van een eiwit voor verschillende liganden kan bepalen [15]. SPR-gebaseerde beoordeling van HGF-bindingsaffiniteit voor zijn receptoren, c-Met en heparansulfaat-proteoglycaan (HSPG), zou snel en gevoelig HGF-varianten met verschillende biologische activiteiten kunnen onderscheiden [16-17].

We hebben eerder de concentratie van HGF in CSF bestudeerd voor patiënten met door de gemeenschap verworven meningitis [7]. We hebben ook aangetoond dat de aanwezigheid van biologisch actief HGF op de plaats van de verwonding wijst op een acute lokale ontsteking [18]. Tijdens een recente studie hebben we beoordeeld of HGF-concentraties en HGF-bindingsaffiniteit voor zijn receptoren kunnen dienen als markers om onderscheid te maken tussen meningitis geassocieerd met neurochirurgie en andere oorzaken van infectie. We bepaalden de concentratie en bindingsaffiniteit van HGF bij patiënten met hetzij door de gemeenschap verworven meningitis of met neurochirurgie geassocieerde meningitis, en vergeleken de resultaten met patiënten met de ziekte van Alzheimer of controles met normaal CSF. We hebben aangetoond dat bepaling van HGF in CSF kan worden gebruikt als een indicator, complementair aan de klinische status en routinematige laboratoriumbevindingen, voor het diagnosticeren van bacteriële invasie in de CSF in een vroeg stadium van de ziekte [18].

Het probleem:

Case report: 76-jarige vrouw met hoge bloeddruk werd door haar buren bewusteloos in haar tuin gevonden op 28 oktober 2009. De CT-scan onthulde een subarachnoïdale bloeding en neuro-angiografie onthulde 3 aneurysma's. Ze werd opgenomen op de afdeling neurochirurgie en werd op 29 oktober geopereerd met ventriculaire drainage en endovasculaire occlusie van de aneurysma's. Ze werd na de operatie geëxtubeerd, maar ze leed aan verlamming van haar linkerarm en -been en vermoeidheid. Sinds 30 oktober had ze lichte koorts en licht verhoogde CRP en procalcitonine. Hersenvocht toonde 170.000 rode en 630 witte bloedcellen en lactaat 5.8. De thoraxfoto toonde een verdachte infiltratie. De bloed- en CSF-kweken werden veiliggesteld. De kweken genomen vanaf 5 november toonden een significante groei van Enterobacter cloacae en Staphylococcus aurous in de urine en groei van Staphylococcus aurous in de nasopharynx. Ze kreeg geen antibiotische therapie en de parameters daalden spontaan, maar de lage graad van koorts hield aan. De CSF-bloedcellen namen toe tot 23.000 rode en 106 witte bloedcellen (11 november) en CSF-lactaat was 4,5 (lumbale drainage). Hoewel CRP binnen het normale bereik lag, kreeg ze 2 g x 3 meropenen onder verdenking van bacteriële meningitis. Eerst op 19 november toonden de CSF-kweken die op 11 november waren genomen groei van Propionibacterium acnes. Het antibioticaregime duurde tot 23 november. Ze leed aan desoriëntatie, vermoeidheid en had hydrocephalus. Ze onderging op 23 november een shuntoperatie. Zij is overleden op 2 december 2009. Reeds op 2 november werd een hoge concentratie HGF en verhoogde bindingsaffiniteit voor HSPG gevonden in CSF-analyse.

Vanwege de uitdagingen bij het stellen van een diagnose en het ontbreken van gouden standaarden, zijn artsen gemotiveerd om vermoedelijke infecties individueel te behandelen, omdat er geen diagnostische methode is die de infectiefocus op tijd kan identificeren. PCR voor bacteriële panel- en virusdetectie in CSF is een gevoelige methode. Het kan echter ook de gekoloniseerde bacteriën detecteren. De aanwezigheid van bacteriën is niet hetzelfde als infectie. Daarom kunnen we in gevallen van bacteriële meningitis, vooral na hersenchirurgie en de vreemde lichamen die in de hersenen worden ingebracht, niet volledig vertrouwen op positieve of negatieve culturen. Een complementaire methode (voor de standaard beschikbare methoden in het laboratorium) met een hoge negatief voorspellende waarde verhoogt de specificiteit van testen en verlaagt de kosten, tijd en complicaties zoals ziekenhuisinfecties (HAI) aanzienlijk.

De methode, omgekeerde metachromatie:

Het N-uiteinde van HGF (Hairpin Loop) is geïdentificeerd als de bindingsplaats voor zowel c-Met als HSPG. Er is een hoge correlatie tussen binding van HGF aan HSPG en aan dextraansulfaat in het SPR-systeem (fig. 1). Metochromasie is een kenmerkende kleurverandering die bepaalde anilinekleurstoffen vertonen wanneer ze gebonden zijn aan chromotrope stoffen [19]. Dit fenomeen wordt veel gebruikt bij de studie van weefselcoupes. Methyleenblauw (O-toluidine) wordt beschouwd als een uitstekende metachromatische kleurstof. Na binding aan polysacchariden met een hoog molecuulgewicht, zoals dextraansulfaat, verandert de kleur van de indicatoroplossing van blauw in rood [19].

Combinaties van dextraansulfaat en O-toluïdine in verschillende verhoudingen produceren paars-rood gekleurde oplossingen van verschillende intensiteit. Gecoate, op maat gemaakte filterpapieren vormen oppervlakken die op stroken worden geplaatst. Wanneer het in contact komt met biologische oplossingen, vervangt het HGF-monster competitief O-toluïdine voor binding aan dextraansulfaat en keert de kleur van het oppervlak terug naar blauw (figuur 2). Dit platform detecteert de aanwezigheid van HSPG-bindende eiwitten zoals HGF in lichaamsvloeistoffen, waaronder slijmoplossend middel, urine, zweerafscheiding, cerebrospinale vloeistof en gewrichtseffusie tijdens infectie. Grote hoeveelheden eiwit of hoge pH veroorzaken geen niet-specifieke reacties met dit apparaat.

Het studieplan:

Studieleider: Amir Ramezani

De procedure:

CSF-specimens, urine en sputum (n=500) worden verzameld van patiënten (1-99 jaar oud) die een hersentumoroperatie, intracerebrale bloeding, shuntdisfunctie of schedelfractuur hebben ondergaan. De monsters worden ingevroren bij -20°C totdat de analyses zijn uitgevoerd. Er zijn geen uitsluitingscriteria.

Regelt de ziekte van Alzheimer (n=20)

• CSF-monsters werden verzameld en ingevroren gehouden van patiënten (N=20) bij wie de ziekte van Alzheimer was vastgesteld in de Memory Clinic, Skåne University Hospital in Malmö. De herziene DSM-III- en NINDS-ADRDA-criteria werden gebruikt voor de diagnose van Alzheimer-dementie (deze onderzoeksgroep is opgenomen in eerdere studies).
• Normaal CSF
• Deze groep bestaat uit patiënten die een lumbaalpunctie hebben ondergaan om meningitis uit te sluiten, en ze hadden normale liquor.
• Analyse van ligandbindingsaffiniteit met oppervlakte-plasmonresonantie
• De biologische activiteit van HGF wordt geanalyseerd met SPR. We meten de bindingsaffiniteit voor HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) en voor een c-Met recombinante hersenschim (R&D Systems), zoals eerder beschreven.
• Metingen van HGF-concentraties in monsters Een specifieke enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-kit (Quantikine Human HGF-immunoassay, minimaal detecteerbare limiet: 0,04 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, VS) werd gebruikt om HGF-concentraties in CSF te bepalen, sputum en urine volgens de instructies van de fabrikant. Alle metingen werden uitgevoerd met een ELISA-lezer (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Oostenrijk) bij 450 nm, die werd gekalibreerd met de recombinante humane HGF-referentiemonsters en de standaarden die in de kit worden geleverd.
• Omgekeerde methachromatie De studiestriptest wordt uitgevoerd op alle monsters.
• Routinematige laboratoriumbeoordelingen
• CSF wordt geanalyseerd om parameterwaarden te bepalen op de afdeling Klinische Chemie, Universitaire Ziekenhuizen, in Linköping. Alle kweken, PCR-testen, antigeendetectietesten en serologische beoordelingen worden uitgevoerd op de afdeling Microbiologie, Universitair Ziekenhuis, Linköping, Zweden.
• CSF-cellen: uitgevoerd door handmatige fasecontrastmicroscopie (Zeiss) met behulp van Jessen Chamber voor het tellen van het aantal erytrocyten en leukocyten (polymorfonucleaire neutrofielen en monocyten).
• CSF-lactaat: Uitgevoerd met behulp van tafelmodel bloedgasanalysator ABL 800 (Radiometer Medical ApS Denemarken).
• Antigeendetectie: antigeen (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides groep A, groep B/Escherichia coli K1, groep C en groep Y/135, Streptococcus agalactiae) wordt gedetecteerd met de latexagglutinatiemethode Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Frankrijk) .
• CSF-cultuur: uitgevoerd in aerobe en anaerobe kolven, evenals in Hematin-platen.
• Virusdetectie PCR: Herpesvirus type 1 en 2 (HSV1, HSV 2) en HZV-DNA werden gedetecteerd met PCR. Humaan enterovirus (HEV) werd geanalyseerd met een geautomatiseerd instrument (Cepheid GeneXpert).
• statistische analyse
• Omdat de HGF-concentraties en bindingsaffiniteitsgegevens niet normaal verdeeld zijn, zijn niet-parametrische tests Kruskal-Wallis-test gevolgd door de Mann-Whitney U-test of de Wilcoxon-matched pairs-test geschikt voor analyse. De analyse van de testprestaties moet handmatig worden uitgevoerd.

Klinische evaluatie van het platform in een dextransulfaat-bevattende gel Met behulp van een omgekeerde methachromatiebenadering hebben we in totaal 656 fecesmonsters bestudeerd met de gevoeligheid, specificiteit, positief voorspellende waarde en negatief voorspellende waarde, evenals de nauwkeurigheid werden berekend in de volgende groepen : geverifieerde infectieuze gastro-enteritis (n=207) en andere oorzaken van diarree, waaronder IBD (n=268). De test kon acute infectieuze gastro-enteritis onderscheiden met een sensitiviteit van 96,6% en specificiteit 92,4%, en een positief voorspellende waarde van 90,9% en negatief voorspellende waarde van 97,2%. De nauwkeurigheid van de test was 94,3%. Er werd geen significante correlatie tussen de testresultaten en faeces calprotectine gevonden (R2=0·056). Er werd geen significante correlatie gevonden tussen de resultaten van de indextest en de aanwezigheid van bloed in de ontlasting (R2=0·08) [20].

Klinische evaluatie van HGF als marker om septische meningitis te onderscheiden van andere oorzaken van pleocytose [18] De buiten het ziekenhuis opgelopen septische meningitis vertoonde een significant hogere HGF-concentratie (p=0,0133), evenals HGF-bindingsaffiniteit voor de c-Met- en HSPG-receptoren (respectievelijk p=0,0007 en p=0,0009) in vergelijking met nosocomiale meningitis. CSF-monsters van patiënten met septische meningitis (inclusief zowel buiten het ziekenhuis opgelopen als nosocomiaal) waren significant hoger in HGF-concentraties (p=0,0014), HGF-binding aan HSPG (p<0,0001) en HGF-binding aan c-Met (p<0,0001) vergeleken met monsters van patiënten met aseptische (virale en subacute) meningitis. CSF-monsters van patiënten met septische meningitis waren hoger van monsters van de controlegroep (patiënten met normaal CSF) en van patiënten met de ziekte van Alzheimer in HGF-concentratie (p<0,0001, p=0,0010, respectievelijk), HGF-binding aan HSPG (respectievelijk p<0,0001 en p=0,9) en HGF-binding aan c-Met (beide p<0,0001).

Vergeleken met monsters van patiënten die neurochirurgie hadden ondergaan en andere infectieziekten hadden, hadden CSF-monsters van patiënten met nosocomiale meningitis significant hogere HGF-concentraties (p<0,0001) en HGF-bindingsaffiniteit voor c-Met (p<0,0001) en HSPG (p= 0,043) receptoren (Figuur 3-4).

Figuur Legenda Afb. 1. Volgorde van een deel van de HGF α-keten. De vergrote codons coderen voor aminozuren die belangrijk zijn voor binding aan HSPG en de c-Met-receptor.

Fig. 2. De theoretische ondersteuning voor de tweede benadering voor een apparaat om de aanwezigheid van HGF in lichaamsvloeistoffen tijdens een infectie te detecteren. (1) Glucosaminoglycan (GAG) polymeerketen met negatieve ladingen. (2) Positieve TBO-moleculen hechten zich aan de polymeerketen, worden vervolgens geconcentreerd en vormen stapels. De kleur verandert van blauw naar rood. (3) Een monster met HGF wordt toegevoegd, dat bindt aan GAG. (4) TBO-molecuulstapels worden vernietigd en worden vrij opgeloste TBO-moleculen. De kleur verandert van rood naar blauw.

Figuur 3: stroomschema van de selectie van CSF-specimens uit patiënt- en controlegroepen. Extra monsters zijn de monsters genomen tijdens verblijf op de afdeling van patiënten met nosocomiale meningitis.

Figuur 4: Eigenschappen van HGF afgeleid van verschillende CSF-monsters werden geanalyseerd met behulp van oppervlakte-plasmon- en ELISA-technieken. (A) Binding aan c-Met-receptoren; (B) Binding aan HSPG-receptoren; (C) HGF-concentraties (mediaan). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

De snelle ontwikkeling en verspreiding van antimicrobieel resistente bacteriën in combinatie met onvoldoende ontwikkeling van nieuwe actieve geneesmiddelen hebben ernstige gevolgen voor de toekomstige anti-infectieuze therapie van bacteriële infecties, vooral die veroorzaakt door Gram-negatieve staafjes. Experts in het veld schatten dat de wereld tegen het volgende decennium getuige zal zijn geweest van de brede verspreiding van onbehandelbare (of bijna onbehandelbare) infecties, zowel binnen als buiten ziekenhuizen. Om deze crisis te voorkomen of op zijn minst te proberen te vertragen, hebben veel onderzoekers hun best gedaan om factoren op te helderen die de opkomst en wereldwijde verspreiding van antimicrobieel resistente bacteriën bevorderen. Een effectieve strategie om de opkomst van meervoudig resistente stammen te beperken, kan het sturen van de antibioticatherapie zijn door gevallen te identificeren die al dan niet met antibiotica moeten worden behandeld, het vermijden van breedspectrumantibioticumtoediening en het promoten van meer specifieke behandelingen.

Wat nodig is, is een eenvoudige, nauwkeurige, kosteneffectieve en haalbare test die antwoord geeft op cruciale vragen.

Om de klinische relevantie en de prestaties van een dergelijke test te beoordelen, is er geen betere omgeving dan de Zweedse gezondheidszorg die de relevante en moderne beoordeling van ziekten en evidence-based therapie voor bijna alle patiënten biedt. Een dergelijke omgeving is een kans om de patiëntenopname en evaluatie van de onderzoekstest uit te voeren in vergelijking met de meest betrouwbare standaardhulpmiddelen zoals culturen, bloedonderzoeken en röntgenfoto's. Deze bronnen zijn niet automatisch beschikbaar in enig ander centrum met zulke betrouwbare, niet-commerciële en onpartijdige eigenschappen.

dnr 2015-429-32