脳神経外科手術後の患者における感染病巣の検出のための迅速な検査。

肝細胞増殖因子 (HGF) は、慢性炎症中に生物学的に不活性になり、細胞外マトリックスのグリコサミノグリカンへの結合親和性を失う再生特性を持つ局所急性期タンパク質です。 HGF は消化管に排泄され、通常の尿では検出されません。 院内髄膜炎は、感染によって脳外科手術が複雑になると発生する可能性があります。 根底にある CNS 疾患プロセスおよび in situ の CNS デバイスにより、院内細菌性髄膜炎の主な病原体は市中感染性髄膜炎の病原体とは異なります。 例えば、院内感染では、成長の遅い日和見微生物が優勢です。 CSF 白血球プロファイルは脳内出血の影響を受け、虚血のために CSF 乳酸が上昇する可能性があります。 さらに、脳神経外科手術後に発熱した人工呼吸器を使用している患者では、意識の変化により診断を確立することが難しくなる可能性があります。 言い換えれば、損傷した脳が環境細菌叢によって侵略されているかどうかを判断することはしばしば困難です.

診断を確定する際の課題とゴールド スタンダードの欠如により、医師は、深刻な病気の疑いのある感染症を広域スペクトルの抗生物質で治療するよう動機づけられています。 多剤耐性菌、高コスト、および新しい抗生物質に関連する合併症の新たな問題により、抗生物質の消費を最小限に抑えることができる診断検査が求められています。

現在、細菌性髄膜炎の診断は、直接顕微鏡、白血球、乳酸、タンパク質の鑑別分析、および血液とCSFの培養の標準的な方法に基づいています。 ただし、脳神経外科手術後の感染症は、脳神経外科手術の影響と区別するのが困難です。 さらに、予防治療により、培養は多くの患者グループで陰性であり、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌やアクネ菌のような皮膚フローラの存在は、感染または汚染のいずれかを示している可能性があります。 この生命を脅かす状態からの生存は、迅速な診断と、可能性のある病原体をカバーするように設計された迅速な経験的抗生物質療法にかかっています。

感染の焦点はどこですか？ 細菌性（敗血症性）髄膜炎ですか？ 広域抗生物質の投与は適応となりますか? プロジェクトの背景: 中枢神経系 (CNS) への細菌の侵入に続いて、クモ膜腔、軟膜、および脳脊髄液 (CSF) に影響を与える急速に進化する炎症プロセスが続きます。 この状態は、頭痛、発熱、および髄膜症の臨床症状につながります。 炎症反応は、髄膜細胞からクモ膜下腔へのさまざまな炎症誘発性サイトカインの放出によって引き起こされます。 その結果、好中球はくも膜下腔に移動し、CSF で細胞増殖を引き起こします。 その結果として、血液脳関門の破壊、脳浮腫、脳血流の減少、低灌流の焦点領域、血管血栓症、虚血、嫌気性解糖経路を介したグルコース代謝の増強、および脳とCSFでの乳酸蓄積の増強が含まれます[ 1]。 この生命を脅かす状態からの生存は、迅速な診断と、可能性のある病原体をカバーするように設計された迅速な経験的抗生物質療法にかかっています。

熱性髄膜炎の他の原因には、急性ウイルス性髄膜炎および非化膿性髄膜炎が含まれ、臨床像は通常、亜急性または慢性です。 診断手順は、細胞と細菌の CSF を分析するための腰椎穿刺、血液と CSF の微生物培養、PCR と抗原検出を含む血清学的検査、および X 線撮影技術で構成されます [2]。 市中感染性髄膜炎では、CSF 分析からの識別値の組み合わせにより、急性細菌性髄膜炎を他の歩行不可能な原因から非常に高い感度で区別できます [3]。

院内髄膜炎は、脳外科手術が感染によって複雑化した場合に発生する可能性があります[2]。 根底にある CNS 疾患プロセスおよび in situ の CNS デバイスにより、院内細菌性髄膜炎の主な病原体は市中感染性髄膜炎の病原体とは異なります。 CSF 白血球プロファイルは脳内出血の影響を受け、虚血のために CSF 乳酸が上昇する可能性があります。 さらに、脳神経外科手術後に発熱した人工呼吸器を使用している患者では、意識の変化により診断を確立することが難しくなる可能性があります。

肝細胞増殖因子 (HGF) は、臓器損傷時に間葉系細胞によって産生されます。 一本鎖の前駆体タンパク質として産生され、損傷部位でタンパク質分解切断によって活性化され、HGF の二本鎖の活性型になります [4]。 活性型 HGF は、細胞分裂 [4] と細胞運動性を刺激し、損傷部位に隣接する上皮細胞の正常な形態形成構造 [5] を促進します。 したがって、HGF は損傷した組織の再生と再ペアリングを誘導します [6]。 高レベルの全身性 HGF は、感染による損傷時に検出されています [7]。 細菌性髄膜炎、肺炎、急性細菌性胃腸炎では、感染部位で HGF が局所的に産生されます [7-9]。 細菌感染時に局所的に産生される HGF は生物学的に活性です [10]。 生物学的に活性な HGF の適用は、パイロット研究で慢性下肢潰瘍の治癒を促進しました [11]。 効果的な抗生物質療法は、感染中の全身の HGF レベルを低下させます [12-13]。 HGF は、治癒特性を持つ局所急性期タンパク質と見なされる可能性があります [14]。

受容体への内因性 HGF 結合の質は、表面プラズモン共鳴 (SPR) で評価できます。これは、いくつかのリガンドに対するタンパク質の親和性を決定できる臨床研究に適した光学技術です [15]。 その受容体、c-Met およびヘパラン硫酸プロテオグリカン (HSPG) に対する HGF 結合親和性の SPR ベースの評価は、異なる生物学的活性を持つ HGF バリアントを迅速かつ高感度に識別することができます [16-17]。

以前に、市中感染性髄膜炎患者の CSF 中の HGF 濃度を研究しました [7]。 また、損傷部位に生物学的に活性な HGF が存在することは、急性局所炎症を示していることも示しました [18]。 最近の研究では、HGF 濃度とその受容体に対する HGF 結合親和性が、脳神経外科手術に伴う髄膜炎と他の感染原因とを区別するためのマーカーとして役立つかどうかを評価しました。 市中感染性髄膜炎または脳神経外科関連髄膜炎患者の HGF の濃度と結合親和性を測定し、その結果をアルツハイマー病患者または正常な CSF の対照と比較しました。 CSF 中の HGF の測定は、疾患の初期段階での CSF への細菌の侵入を診断するために、臨床状態および日常的な検査所見を補完する指標として使用できることを示しました [18]。

問題：

事例報告: 76 歳の高血圧の女性が、2009 年 10 月 28 日に自宅の庭で意識を失っているのを近所の人に発見されました。 CT スキャンでくも膜下出血が明らかになり、神経血管造影で 3 つの動脈瘤が明らかになりました。 彼女は脳神経外科に入院し、10 月 29 日に心室ドレナージと動脈瘤の血管内閉塞で手術を受けました。 彼女は手術後に抜管されましたが、左腕と脚の麻痺と疲労に苦しんでいました. 10 月 30 日以降、彼女は微熱で、CRP とプロカルシトニンがわずかに上昇しました。 脳脊髄液は、170,000 の赤血球と 630 の白血球、および乳酸 5.8 を示しました。 胸部レントゲンで浸潤の疑いがありました。 血液とCSFの培養物は保護されました。 11 月 5 日から採取した培養では、尿中の Enterobacter cloacae と Staphylococcus aurous の有意な増殖と、鼻咽頭での Staphylococcus aurous の増殖が明らかになりました。 彼女は抗生物質療法を受けず、パラメーターは自然に減少しましたが、微熱は続きました。 CSF 血球は 23000 赤血球と 106 白血球 (11 月 11 日) に増加し、CSF 乳酸は 4.5 (腰椎ドレナージ) でした。 CRPは正常範囲内でしたが、細菌性髄膜炎の疑いでメロペネン2g×3を投与されました。 まず 11 月 19 日に採取された CSF 培養物は、11 月 11 日にプロピオニバクテリウム アクネスの増殖を明らかにしました。 抗生物質投与は 11 月 23 日まで続きました。 彼女は見当識障害、疲労、水頭症を患っていました。 彼女は11月23日にシャント手術を受けました。 彼女は 2009 年 12 月 2 日に亡くなりました。 高濃度の HGF と HSPG への高い結合親和性が、11 月 2 日の CSF 分析で既に発見されました。

診断を確立する際の課題とゴールド スタンダードの欠如により、医師は疑わしい感染症を個別に治療するように動機付けられています。 CSF 中の細菌パネルおよびウイルス検出のための PCR は、感度の高い方法です。 ただし、定着したバクテリアも検出する可能性があります。 細菌の存在は感染と同じではありません。 したがって、特に脳手術後の細菌性髄膜炎の場合、および脳に挿入された異物の場合、陽性または陰性の培養に完全に依存することはできません. 高い陰性適中率を持つ補完的な方法 (検査室で利用可能な標準的な方法) は、検査の特異性を高め、費用、時間、および院内感染 (HAI) などの合併症を大幅に減少させます。

メソッド、逆メタクロマシー:

HGF (Hairpin Loop) の N 末端は、c-Met と HSPG の両方への結合部位として同定されています。 HGF の HSPG への結合と SPR システムのデキストラン硫酸への結合の間には高い相関関係があります (図 1)。 メトクロマジアは、特定のアニリン染料がクロモ トロープ物質に結合したときに示す特徴的な色の変化です [19]。この現象は、組織切片の研究で広く使用されています。 メチレン ブルー (O-トルイジン) は、優れた異染性色素と見なされます。 デキストラン硫酸などの高分子量多糖類に結合すると、指示薬溶液の色が青から赤に変わります [19]。

デキストラン硫酸と O-トルイジンをさまざまな比率で組み合わせると、さまざまな強度の赤紫の溶液が生成されます。 コーティングされたカスタマイズされたろ紙は、ストリップに配置される表面を構成します。 生物学的溶液と接触すると、サンプルの HGF は競合的に O-トルイジンを置き換えてデキストラン硫酸に結合し、表面の色は青色に戻ります (図 2)。 このプラットフォームは、去痰薬、尿、潰瘍分泌物、脳脊髄液、感染時の関節液などの体液中の HGF などの HSPG 結合タンパク質の存在を検出します。 多量のタンパク質または高 pH は、このデバイスで非特異的な反応を引き起こしません。

学習計画:

研究リーダー: Amir Ramezani

手順：

ＣＳＦ標本、尿および喀痰（ｎ＝５００）は、脳腫瘍手術、脳内出血、シャント機能不全または頭蓋骨骨折を受けた患者（１～９９歳）から収集される。 分析が行われるまで、標本は-20℃で凍結保存されます。 除外基準はありません。

アルツハイマー病の抑制 (n=20)

• CSF サンプルは、マルメのスコーネ大学病院のメモリー クリニックでアルツハイマー病と診断された患者 (N = 20) から収集され、凍結保存されました。 改訂された DSM-III および NINDS-ADRDA 基準は、アルツハイマー型認知症の診断に使用されました (この研究グループは以前の研究に含まれていました)。
• 正常なCSF
• このグループは、髄膜炎を除外するために腰椎穿刺を受けた患者で構成され、CSF は正常でした。
• 表面プラズモン共鳴によるリガンド結合親和性の解析
• HGF の生物学的活性は、SPR で分析されます。 前述のように、HSPG (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) および c-Met 組換えキメラ (R&D Systems) に対する結合親和性を測定します。
• サンプル中の HGF 濃度の測定 特定の酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA) キット (Quantikine Human HGF イムノアッセイ、最小検出限界: 0.04 ng/mL; R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州、米国) を使用して、CSF 中の HGF 濃度を決定しました。メーカーの指示に従って、喀痰と尿。 すべての測定は、450 nm で ELISA リーダー (Expert96; AsysHitech GmbH、オーストリア、オイゲンドルフ) を使用して実行され、キットに含まれる組換えヒト HGF 参照サンプルと標準で較正されました。
• リバース メタクロマシー スタディ ストリップ テストは、すべての標本に対して実行されます。
• ルーチン検査評価
• CSF は、リンシェーピングの大学病院の臨床化学部門で分析され、パラメーター値が決定されます。 すべての培養、PCR アッセイ、抗原検出アッセイ、および血清学的評価は、スウェーデンのリンシェーピングにある大学病院の微生物学科で行われます。
• ＣＳＦ細胞：赤血球および白血球（多形核好中球および単球）の数を計数するためのＪｅｓｓｅｎ Ｃｈａｍｂｅｒを使用して手動位相差顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ）によって実施した。
• CSF乳酸塩：卓上型血液ガス​​分析装置ABL 800（Radiometer Medical ApS Denmark）を使用して実施。
• 抗原検出: 抗原 (肺炎球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌グループ A、グループ B/大腸菌 K1、グループ C およびグループ Y/135、ストレプトコッカス アガラクティエ) は、ラテックス凝集法 Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad、フランス) によって検出されます。 .
• ＣＳＦ培養：好気性および嫌気性フラスコならびにヘマチンプレートで実施。
• ウイルス検出 PCR: ヘルペス ウイルス 1 型および 2 型 (HSV1、HSV 2) および HZV DNA が PCR によって検出されました。 ヒト エンテロ ウイルス (HEV) は、自動化された機器 (Cepheid GeneXpert) によって分析されました。
• 統計分析
• HGF 濃度と結合親和性データは正規分布していないため、ノンパラメトリック検定のクラスカル・ウォリス検定とそれに続くマン・ホイットニーの U 検定またはウィルコクソンの対応ペア検定が分析に適しています。 テスト性能の分析は手動で行うものとします。

デキストラン硫酸含有ゲルでのプラットフォームの臨床評価 リバース メタクロマシー アプローチを使用して、合計 656 の糞便サンプルを調査しました。 : 確認された感染性胃腸炎 (n=207) および IBD (n=268) を含む下痢の他の原因。 この検査では、感度 96.6%、特異度 92.4%、陽性適中率 90.9%、陰性適中率 97.2% で急性感染性胃腸炎を識別することができました。 テストの精度は 94.3% でした。 試験結果と糞便カルプロテクチンとの間に有意な相関は見られなかった(R2=0.056)。 指標試験の結果と便中の血液の存在との間に有意な相関関係は観察されませんでした (R2=0.08) [20]。

敗血症性髄膜炎を他の細胞増加症の原因と区別するためのマーカーとしての HGF の臨床評価 [18] 市中感染性敗血症性髄膜炎は、有意に高い HGF 濃度 (p=0.0133) と、c-Met および HSPG 受容体に対する HGF 結合親和性を示しました。 （それぞれ p = 0.0007 および p = 0.0009）院内髄膜炎と比較して。 敗血症性髄膜炎患者（市中感染および院内感染の両方を含む）のCSFサンプルは、HGF濃度が有意に高かった（p=0.0014）。 HSPG への HGF の結合 (p<0.0001)、および c-Met への HGF の結合 (p<0.0001) 無菌性（ウイルス性および亜急性）髄膜炎患者のサンプルと比較。 敗血症性髄膜炎患者のCSFサンプルは、対照群（CSFが正常な患者）およびアルツハイマー病患者のサンプルよりもHGF濃度が高かった（p<0.0001、 それぞれｐ＝０．００１０）、ＨＳＰＧへのＨＧＦ結合（それぞれｐ＜０．０００１およびｐ＝０．９）、およびｃ－ＭｅｔへのＨＧＦ結合（両方ともｐ＜０．０００１）。

脳神経外科手術を受け、他の感染症を患っている患者のサンプルと比較して、院内髄膜炎患者の CSF サンプルは、HGF 濃度が有意に高く (p<0.0001)、c-Met (p<0.0001) および HSPG (p= 0.043) 受容体 (図 3-4)。

図の凡例 図 1. HGF α鎖の一部の配列。 拡張されたコドンは、HSPG および c-Met 受容体への結合に重要なアミノ酸をコードします。

図 2. 感染中の体液中の HGF の存在を検出するデバイスの 2 番目のアプローチの理論的サポート。 (1) 負電荷を持つグルコサミノグリカン (GAG) ポリマー鎖。 (2) 正の TBO 分子がポリマー鎖に結合し、濃縮されてスタックを形成します。 青から赤に色が変わります。 (3) GAG に結合する HGF を含むサンプルを添加します。 （４）ＴＢＯ分子スタックが破壊され、自由溶解ＴＢＯ分子となる。 色が赤から青に変わります。

図 3: 患者および対照群からの CSF 標本の選択のフローチャート。 余分なサンプルは、院内髄膜炎患者から入院中に採取されたサンプルです。

図 4: 表面プラズモンおよび ELISA 技術を使用して、さまざまな CSF サンプルに由来する HGF の特性を分析しました。 (A) c-Met受容体への結合。 (B) HSPG 受容体への結合。 (C) HGF 濃度 (中央値)。 *p<0.05, **p<0.01、 ***p<0.001、 ****p<0.0001。

抗菌薬耐性菌の急速な進化と拡散と並行して、新しい有効な薬剤の開発が不十分であることは、細菌感染、特にグラム陰性桿菌による感染の将来の抗感染療法に深刻な影響を与えます。 この分野の専門家は、次の 10 年までに、病院内外で、治療不可能な (または治療不可能に近い) 感染症が広く蔓延するのを目の当たりにするだろうと予測しています。 この危機を回避するか、少なくとも遅らせようとするために、多くの研究者が抗菌薬耐性菌の出現と世界的な広がりを助長する要因を解明することに専念してきました。 複数の耐性株の出現を制限するための効果的な戦略には、抗生物質で治療する必要があるかどうかを特定して抗生物質療法を指示すること、広域抗生物質投与を回避すること、およびより具体的な治療法を促進することが含まれる場合があります。

必要とされているのは、重要な質問に答える、シンプルで正確、費用対効果が高く、実行可能なテストです。

このような検査の臨床的妥当性と性能を評価するために、スウェーデンのヘルスケアよりも優れた環境はありません。スウェーデンのヘルスケアは、ほぼすべての患者に関連する最新の疾患評価とエビデンスに基づく治療を提供しています。 このような環境は、培養、血液検査、X 線などの最も信頼できる標準的なツールと比較して、患者の参加と研究テストの評価を行う機会です。 これらのリソースは、このような信頼性が高く、非営利で公平な特性を持つ他のセンターでは自動的に利用できません。

dnr 2015-429-32