Snabbtest för upptäckt av infektionsfokus hos postneurokirurgiska patienter.

Hepatocyttillväxtfaktor (HGF) är lokalt akutfasprotein med regenerativa egenskaper som blir biologiskt inaktivt under kronisk inflammation och förlorar bindningsaffiniteten till glykosaminoglykan i den extracellulära matrixen. HGF utsöndras i mag-tarmkanalen och detekteras inte i normal urin. Nosokomial meningit kan uppstå när hjärnkirurgiska ingrepp kompliceras av infektion. På grund av underliggande CNS-sjukdomsprocesser och CNS-anordningar in situ skiljer sig de huvudsakliga medlen för nosokomial bakteriell meningit från medlen för samhällsförvärvad meningit. Till exempel, vid sjukhusinfektioner dominerar långsamt växande, opportunistiska mikroorganismer. CSF-leukocytprofilen påverkas av intracerebral blödning, och CSF-laktat kan vara förhöjt på grund av ischemi. Dessutom kan förändrat medvetande göra det svårt att ställa diagnos hos patienter på ventilatorer som utvecklar feber efter neurokirurgiska operationer. Det är med andra ord ofta svårt att avgöra om den skadade hjärnan har invaderats av bakterieflora i miljön.

På grund av utmaningarna med att fastställa en diagnos, och avsaknaden av guldstandarder, är läkare motiverade att behandla misstänkta infektioner vid allvarliga sjukdomar med bredspektrumantibiotika. De framväxande problemen med multiresistensbakterier, höga kostnader och komplikationer relaterade till nya antibiotika har krävt diagnostiska tester som kan minimera antibiotikakonsumtionen.

För närvarande förblir diagnosen bakteriell meningit baserad på standardmetoder för direkt mikroskopi, differentiella analyser av vita blodkroppar, laktat och protein, och kulturer av blod och CSF. Postneurokirurgiska infektioner är dock svåra att skilja från effekterna av neurokirurgiska ingrepp. Dessutom, på grund av profylaxbehandlingar, är odlingarna negativa i en stor grupp patienter, och närvaron av hudflora, som koagulasnegativa Staphylococcus eller Propionbacterium acnes, kan tyda på antingen infektion eller kontaminering. Överlevnad från detta livshotande tillstånd beror på en snabb diagnos och snabb empirisk antibiotikabehandling utformad för att täcka de troliga patogenerna.

Var ligger infektionsfokus? Är det en bakteriell (septisk) meningit? Är bredspektrumtillförsel av antibiotika indicerad? Projektets bakgrund: En invasion av bakterier i det centrala nervsystemet (CNS) följs av en snabbt utvecklande inflammatorisk process som påverkar arachnoidutrymmet, pia matern och cerebrospinalvätskan (CSF). Detta tillstånd leder till kliniska symtom på huvudvärk, feber och meningism. Det inflammatoriska svaret orsakas av frisättningen av olika pro-inflammatoriska cytokiner från meningeala celler till subaraknoidalrummet. Som ett resultat flyttar neutrofiler in i subaraknoidalrummet och orsakar pleocytos i CSF. Konsekvenserna inkluderar nedbrytning av blod-hjärnbarriären, cerebralt ödem, minskat cerebralt blodflöde, fokala områden av hypoperfusion, vaskulär trombos, ischemi, ökad glukosmetabolism via den anaeroba glykolytiska vägen och ökad laktatackumulering i hjärnan och CSF [ 1]. Överlevnad från detta livshotande tillstånd beror på en snabb diagnos och snabb empirisk antibiotikabehandling utformad för att täcka de troliga patogenerna.

Andra orsaker till febril meningit inkluderar akut viral meningit och icke-pyogen meningit, där den kliniska bilden typiskt är subakut eller kronisk. De diagnostiska procedurerna består av en lumbalpunktion för att analysera CSF för celler och bakterier, mikrobiologiska odlingar av blod och CSF, serologiska tester som involverar PCR och antigendetektering, och radiografiska tekniker [2]. Vid samhällsförvärvad meningit kan en kombination av särskiljande värden från CSF-analysen skilja akut bakteriell meningit från andra, icke-ambulatoriska orsaker med ganska hög känslighet [3].

Nosokomial meningit kan uppstå när hjärnkirurgiska ingrepp kompliceras av infektion [2]. På grund av underliggande CNS-sjukdomsprocesser och CNS-anordningar in situ skiljer sig de huvudsakliga medlen för nosokomial bakteriell meningit från medlen för samhällsförvärvad meningit. CSF-leukocytprofilen påverkas av intracerebral blödning, och CSF-laktat kan vara förhöjt på grund av ischemi. Dessutom kan förändrat medvetande göra det svårt att ställa diagnos hos patienter på ventilatorer som utvecklar feber efter neurokirurgiska operationer.

Hepatocyttillväxtfaktor (HGF) produceras av mesenkymala celler under organskada. Det produceras som ett enkelkedjigt prekursorprotein och det aktiveras på skadestället genom proteolysklyvning, vilket resulterar i en dubbelkedjig aktiv form av HGF [4]. Aktiv HGF stimulerar celldelning [4] och cellmotilitet, och det främjar normal morfogen struktur [5] i epitelceller intill skadade områden. Således inducerar HGF regenerering och återparning av skadad vävnad [6]. Höga nivåer av systemisk HGF har upptäckts under skador orsakade av infektion [7]. Vid bakteriell meningit, lunginflammation och akut bakteriell gastroenterit sker lokal produktion av HGF vid infektionsplatsen [7-9]. HGF som produceras lokalt under bakteriell infektion är biologiskt aktiv [10]. Tillämpning av biologiskt aktiv HGF främjade läkning av kroniska bensår i en pilotstudie [11]. Effektiv antibiotikabehandling minskar systemiska HGF-nivåer under infektion [12-13]. HGF kan betraktas som ett lokalt akutfasprotein med helande egenskaper [14].

Kvaliteten på endogen HGF-bindning till receptorer kan bedömas med ytplasmonresonans (SPR), en optisk teknik lämplig för kliniska studier som kan bestämma affiniteten hos ett protein för flera ligander [15]. SPR-baserad bedömning av HGF-bindningsaffinitet för dess receptorer, c-Met och heparansulfatproteoglykan (HSPG), kunde snabbt och känsligt särskilja HGF-varianter med olika biologiska aktiviteter [16-17].

Vi har tidigare studerat koncentrationen av HGF i CSF för patienter med samhällsförvärvad meningit [7]. Vi har också visat att närvaron av biologiskt aktiv HGF vid skadestället indikerar en akut lokal inflammation [18]. Under en nyligen genomförd studie har vi bedömt om HGF-koncentrationer och HGF-bindningsaffinitet för dess receptorer kan fungera som markörer för att skilja mellan hjärnhinneinflammation associerad med neurokirurgi och andra orsaker till infektion. Vi bestämde koncentrationen och bindningsaffiniteten för HGF hos patienter med antingen samhällsförvärvad meningit eller neurokirurgi-associerad meningit, och jämförde resultaten med antingen patienter med Alzheimers sjukdom eller kontroller med normal CSF. Vi har visat att bestämning av HGF i CSF kan användas som en indikator, komplement till klinisk status och rutinmässiga laboratoriefynd, för att diagnostisera bakteriell invasion i CSF i ett tidigt stadium av sjukdomen [18].

Problemet:

Fallrapport: 76 år gammal kvinna med högt blodtryck hittades av sina grannar, medvetslös i sin trädgård den 28 oktober 2009. CT-skanningen avslöjade subaraknoidal blödning och neuro-angiografi avslöjade 3 aneurysm. Hon lades in på neurokirurgiska avdelningen och opererades den 29 oktober med ventrikulär dränage och endovaskulär ocklusion av aneurysmerna. Hon extuberades efter operationen, men hon led av förlamning av vänster arm och ben och trötthet. Sedan den 30 oktober hade hon låg feber och något ökat CRP och prokalcitonin. Cerebrospinalvätska visade 170 000 röda och 630 vita blodkroppar och laktat 5,8. Bröströntgen visade en misstänkt infiltration. Blod- och CSF-odlingarna säkrades. Kulturerna tagna från den 5 november avslöjade betydande tillväxt av Enterobacter cloacae och Staphylococcus aurous i urin och tillväxt av Staphylococcus aurous i nasofarynx. Hon fick ingen antibiotikabehandling och parametrarna minskade spontant men låg feber fortsatte. CSF-blodkropparna ökade till 23 000 röda och 106 vita blodkroppar (11 november), och CSF-laktat var 4,5 (lumbal dränage). Även om CRP låg inom normalområdet fick hon meropenen 2g x 3 under misstanke om bakteriell meningit. Först den 19 november visade CSF-kulturerna som togs den 11 november tillväxt av Propionibacterium acnes. Antibiotikaregimen fortsatte till den 23 november. Hon led av desorientering, trötthet och hade hydrocefalus. Hon genomgick en shuntoperation den 23 november. Hon dog den 2 december 2009. Hög koncentration av HGF och förhöjd bindningsaffinitet till HSPG hittades i CSF-analys redan den 2 november.

På grund av utmaningarna med att fastställa en diagnos, och avsaknaden av guldstandarder, är läkare motiverade att behandla misstänkta infektioner individuellt eftersom det inte finns någon diagnostisk metod som kan identifiera infektionsfokus i tid. PCR för bakteriepanel och virusdetektion i CSF är en känslig metod. Men det kan också upptäcka de koloniserade bakterierna. Förekomsten av bakterier är inte detsamma som infektion. Därför kan vi inte förlita oss på positiva eller negativa kulturer helt och hållet i fall av bakteriell meningit, särskilt efter hjärnkirurgi och främmande kroppar som sätts in i hjärnan. En kompletterande metod (för de standardmetoder som finns tillgängliga på laboratoriet) med högt negativt prediktivt värde ökar testernas specificitet och minskar kostnaderna, tiden och komplikationerna såsom sjukhusförvärvade infektioner (HAI) avsevärt.

Metoden, omvänd metachromacy:

N-terminalen av HGF (Hairpin Loop) har identifierats som bindningsstället till både c-Met och HSPG. Det finns en hög korrelation mellan bindning av HGF till HSPG och till dextransulfat i SPR-systemet (fig 1). Metokromasi är en karakteristisk färgförändring som vissa anilinfärgämnen uppvisar när de binds till kromotropiska ämnen [19]. Detta fenomen har använts i stor utsträckning vid studiet av vävnadssnitt. Metylenblått (O-toluidin) anses vara ett utmärkt metakromatisk färgämne. Vid bindning till högmolekylära polysackarider, såsom dextransulfat, ändras färgen på indikatorlösningen från blå till röd [19].

Kombinationer av dextransulfat och O-toluidin i olika proportioner ger lila-röda lösningar av varierande intensitet. Bestrukna anpassade filterpapper utgör ytor som placeras på remsor. När det är i kontakt med biologiska lösningar ersätter provet HGF konkurrenskraftigt O-toluidin för bindning till dextransulfat och färgen på ytan återgår till blå (Fig 2). Denna plattform detekterar närvaron av HSPG-bindande proteiner såsom HGF i kroppsvätskor inklusive slemlösande medel, urin, sårsekret, cerebrospinalvätska och ledutgjutning under infektion. Höga mängder protein eller högt pH orsakar inte ospecifika reaktioner med denna enhet.

Studieplanen:

Studieledare: Amir Ramezani

Proceduren:

CSF-prover, urin och sputum (n=500) tas från patienter (1-99 år gamla) som har genomgått hjärntumörkirurgi, intracerebral blödning, shuntdysfunktion eller skallfraktur. Proverna hålls frysta i -20°C tills analyser utfördes. Det finns inga uteslutningskriterier.

Styr Alzheimers sjukdom (n=20)

• CSF-prover samlades in och hölls frysta från patienter (N=20) som diagnostiserades med Alzheimers sjukdom vid Minneskliniken, Skånes universitetssjukhus i Malmö. De reviderade DSM-III- och NINDS-ADRDA-kriterierna användes för diagnos av Alzheimers demens (denna studiegrupp har inkluderats i tidigare studie).
• Normal CSF
• Denna grupp består av patienter som har genomgått lumbalpunktion för att utesluta meningit, och de hade normal CSF.
• Analys av ligandbindande affinitet med ytplasmonresonans
• Den biologiska aktiviteten av HGF analyseras med SPR. Vi mäter bindningsaffiniteten till HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) och till en c-Met rekombinant chimär (R&D Systems), som tidigare beskrivits.
• Mätningar av HGF-koncentrationer i prover En specifik enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA)-kit (Quantikine Human HGF-immunanalys, lägsta detekterbar gräns: 0,04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) användes för att bestämma HGF-koncentrationer i CSF, sputum och urin enligt tillverkarens instruktioner. Alla mätningar utfördes med en ELISA-läsare (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Österrike) vid 450 nm, som kalibrerades med de rekombinanta humana HGF-referensproverna och de standarder som tillhandahålls i kitet.
• Omvänd metakromati Testet av testremsor utförs på alla prover.
• Rutinmässiga laboratoriebedömningar
• CSF analyseras för att fastställa parametervärden vid avdelningarna för klinisk kemi, Universitetssjukhusen i Linköping. Alla odlingar, PCR-analyser, antigendetektionsanalyser och serologiska bedömningar utförs vid Mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset, Linköping, Sverige.
• CSF-celler: Utförs med manuell faskontrastmikroskopi (Zeiss) med användning av Jessen Chamber för att räkna antalet erytrocyter och leukocyter (polymorfonukleära neutrofiler och monocyter).
• CSF-laktat: Utförs med hjälp av bänkblodgasanalysator ABL 800 (Radiometer Medical ApS Danmark).
• Antigendetektering: Antigen (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides grupp A, grupp B/Escherichia coli K1, grupp C och grupp Y/135, Streptococcus agalactiae) detekteras med latexagglutinationsmetoden Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Frankrike) .
• CSF-odling: Utförs i aeroba och anaeroba flaskor samt i hematinplattor.
• Virusdetektion PCR: Herpesvirus typ 1 och 2 (HSV1, HSV 2) och HZV-DNA detekterades med PCR. Humant enterovirus (HEV) analyserades med ett automatiserat instrument (Cepheid GeneXpert).
• Statistisk analys
• Eftersom HGF-koncentrationerna och bindningsaffinitetsdata inte är normalfördelade, är icke-parametriska tester Kruskal-Wallis-test följt av Mann-Whitney U-test eller Wilcoxon matchade par-test lämpliga för analys. Analysen av testprestanda ska utföras manuellt.

Klinisk utvärdering av plattformen i en dextransulfat-innehållande gel Med användning av omvänd metachromacy-metod har vi studerat totalt 656 fecesprover med sensitivitet, specificitet, positivt prediktivt värde och negativt prediktivt värde samt noggrannheten beräknades i följande grupper : verifierad infektiös gastroenterit (n=207) och andra orsaker till diarré, inklusive IBD (n=268). Testet kunde särskilja akut infektiös gastroenterit med en sensitivitet på 96,6 % och specificitet 92,4 % och ett positivt prediktivt värde på 90,9 % och negativt prediktivt värde på 97,2 %. Testnoggrannheten var 94,3 %. Ingen signifikant korrelation mellan testresultaten och feces calprotectin hittades (R2=0·056). Ingen signifikant korrelation observerades mellan resultaten av indextestet och förekomsten av blod i avföringen (R2=0·08) [20].

Klinisk utvärdering av HGF som en markör för att skilja septisk meningit från andra orsaker till pleocytos [18] Den gemenskapsförvärvade septiska meningiten visade signifikant högre HGF-koncentration (p=0,0133), såväl som HGF-bindningsaffinitet till c-Met- och HSPG-receptorerna (p=0,0007 respektive p=0,0009) jämfört med nosokomial meningit. CSF-prover från patienter med septisk meningit (inklusive både samhällsförvärvad och nosokomiell) var signifikant högre i HGF-koncentrationer (p=0,0014), HGF-bindning till HSPG (p<0,0001) och HGF-bindning till c-Met (p<0,0001) jämfört med prover från patienter med aseptisk (viral och subakut) meningit. CSF-prover från patienter med septisk meningit var högre från prover från kontrollgruppen (patienter med normal CSF) och från patienter med Alzheimers sjukdom i HGF-koncentration (p<0,0001, p=0,0010 respektive), HGF-bindning till HSPG (p<0,0001 respektive p=0,9) och HGF-bindning till c-Met (båda p<0,0001).

Jämfört med prover från patienter som genomgått neurokirurgi och hade andra infektionssjukdomar, hade CSF-prover från patienter med nosokomial meningit signifikant högre HGF-koncentrationer (p<0,0001) och HGF-bindningsaffinitet till c-Met (p<0,0001) och HSPG (p= 0,043) receptorer (Figur 3-4).

Figurförklaringar Fig. 1. Sekvens av en del av HGF a-kedjan. De förstorade kodonen kodar för aminosyror som är viktiga för att binda till HSPG och c-Met-receptorn.

Fig. 2. Det teoretiska stödet för det andra tillvägagångssättet för en anordning för att detektera närvaron av HGF i kroppsvätskor under en infektion. (1) Glukosaminoglykan (GAG) polymerkedja med negativ laddning. (2) Positiva TBO-molekyler fäster vid polymerkedjan och koncentreras sedan och bildar staplar. Färgen ändras från blått till rött. (3) Ett prov med HGF tillsätts, som binder till GAG. (4) TBO-molekylstaplar förstörs och blir fritt upplösta TBO-molekyler. Färgen ändras från rött till blått.

Figur 3: Flödesschema över urvalet av CSF-prover från patient- och kontrollgrupper. Extra prover är de prover som tagits under vistelse på avdelningen från patienter med nosokomial meningit.

Figur 4: Egenskaper hos HGF härrörande från olika CSF-prover analyserades med användning av ytplasmon- och ELISA-tekniker. (A) Bindning till c-Met-receptorer; (B) Bindning till HSPG-receptorer; (C) HGF-koncentrationer (median). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

Den snabba utvecklingen och spridningen av antimikrobiella resistenta bakterier parallellt med otillräcklig utveckling av nya aktiva läkemedel påverkar allvarligt framtida anti-infektionsbehandling av bakterieinfektioner, särskilt de som beror på Gram-negativa stavar. Experter på området uppskattar att under det kommande decenniet kommer världen att ha sett den breda spridningen av obehandlade (eller närmast obehandlade) infektioner, både inom och utanför sjukhus. För att undvika eller åtminstone försöka fördröja denna kris har många forskare ägnat sina ansträngningar åt att klarlägga faktorer som gynnar uppkomsten och den globala spridningen av antimikrobiella resistenta bakterier. En effektiv strategi för att begränsa uppkomsten av flera resistenta stammar kan inkludera att styra antibiotikaterapin genom att identifiera fall som bör eller inte bör behandlas med antibiotika, undvika bredspektrumtillförsel av antibiotika och främja mer specifika behandlingar.

Det som behövs är ett enkelt, korrekt, kostnadseffektivt och genomförbart test som svarar på avgörande frågor.

För att bedöma den kliniska relevansen och utförandet av ett sådant test finns det inte en bättre miljö än den svenska sjukvården som ger relevant och modern bedömning av sjukdomar och evidensbaserad terapi för nästan alla patienter. En sådan miljö är en möjlighet att utföra patientinkluderingen och utvärderingen av studietestet i jämförelse med de mest tillförlitliga standardverktygen som odlingar, blodprov och röntgen. Dessa resurser är inte tillgängliga automatiskt i något annat center med sådana tillförlitliga, icke-kommersiella och opartiska egenskaper.

dnr 2015-429-32