Test rapido per la rilevazione del focolaio di infezione nei pazienti post neurochirurgici.

Il fattore di crescita degli epatociti (HGF) è una proteina locale della fase acuta con proprietà rigenerative che diventa biologicamente inattiva durante l'infiammazione cronica e perde l'affinità di legame con i glicosaminoglicani nella matrice extracellulare. L'HGF viene escreto nel tratto gastrointestinale e non viene rilevato nelle urine normali. La meningite nosocomiale può verificarsi quando le procedure chirurgiche cerebrali sono complicate dall'infezione. A causa dei sottostanti processi patologici del SNC e dei dispositivi del SNC in situ, i principali agenti della meningite batterica nosocomiale differiscono dagli agenti della meningite acquisita in comunità. Ad esempio, nelle infezioni nosocomiali predominano i microrganismi opportunisti a crescita lenta. Il profilo dei leucociti del liquor è influenzato dall'emorragia intracerebrale e il lattato del liquor potrebbe essere elevato a causa dell'ischemia. Inoltre, lo stato di coscienza alterato può rendere difficile stabilire una diagnosi nei pazienti sui ventilatori che sviluppano febbre dopo operazioni neurochirurgiche. In altre parole, è spesso difficile stabilire se il cervello danneggiato sia stato invaso dalla flora batterica ambientale.

A causa delle difficoltà nello stabilire una diagnosi e della mancanza di standard aurei, i medici sono motivati ​​a trattare sospette infezioni in malattie gravi con antibiotici ad ampio spettro. I problemi emergenti dei batteri a resistenza multipla, i costi elevati e le complicazioni legate ai nuovi antibiotici hanno richiesto test diagnostici in grado di ridurre al minimo il consumo di antibiotici.

Attualmente, la diagnosi di meningite batterica rimane basata su metodi standard di microscopia diretta, analisi differenziali di globuli bianchi, lattato e proteine ​​e colture di sangue e CSF. Tuttavia, le infezioni post-neurochirurgiche sono difficili da distinguere dagli effetti delle procedure neurochirurgiche. Inoltre, a causa dei trattamenti di profilassi, le colture sono negative in un ampio gruppo di pazienti e la presenza di flora cutanea, come Staphylococcus coagulasi negativo o Propionbacterium acnes, può indicare infezione o contaminazione. La sopravvivenza da questa condizione pericolosa per la vita dipende da una diagnosi rapida e da una tempestiva terapia antibiotica empirica progettata per coprire i probabili agenti patogeni.

Dov'è il focus dell'infezione? È una meningite batterica (settica)? È indicata la somministrazione di antibiotici ad ampio spettro? Lo sfondo del progetto: un'invasione di batteri nel sistema nervoso centrale (SNC) è seguita da un processo infiammatorio in rapida evoluzione che colpisce lo spazio aracnoideo, la pia madre e il liquido cerebrospinale (CSF). Questa condizione porta a sintomi clinici di cefalea, febbre e meningismo. La risposta infiammatoria è causata dal rilascio di varie citochine pro-infiammatorie dalle cellule meningee nello spazio subaracnoideo. Di conseguenza, i neutrofili si spostano nello spazio subaracnoideo e causano la pleiocitosi nel liquido cerebrospinale. Le conseguenze includono la rottura della barriera emato-encefalica, edema cerebrale, ridotto flusso sanguigno cerebrale, aree focali di ipoperfusione, trombosi vascolare, ischemia, aumento del metabolismo del glucosio attraverso la via glicolitica anaerobica e aumento dell'accumulo di lattato nel cervello e nel liquido cerebrospinale. 1]. La sopravvivenza da questa condizione pericolosa per la vita dipende da una diagnosi rapida e da una tempestiva terapia antibiotica empirica progettata per coprire i probabili agenti patogeni.

Altre cause di meningite febbrile comprendono la meningite virale acuta e la meningite non piogenica, in cui il quadro clinico è tipicamente sub-acuto o cronico. Le procedure diagnostiche consistono in una puntura lombare per analizzare il CSF per cellule e batteri, colture microbiologiche di sangue e CSF, test sierologici che coinvolgono PCR e rilevazione dell'antigene e tecniche radiografiche [2]. Nella meningite acquisita in comunità, una combinazione di valori discriminanti dall'analisi del liquido cerebrospinale può differenziare la meningite batterica acuta da altre cause non deambulanti con sensibilità piuttosto elevata [3].

La meningite nosocomiale può verificarsi quando le procedure chirurgiche cerebrali sono complicate dall'infezione [2]. A causa dei sottostanti processi patologici del SNC e dei dispositivi del SNC in situ, i principali agenti della meningite batterica nosocomiale differiscono dagli agenti della meningite acquisita in comunità. Il profilo dei leucociti del liquor è influenzato dall'emorragia intracerebrale e il lattato del liquor potrebbe essere elevato a causa dell'ischemia. Inoltre, lo stato di coscienza alterato può rendere difficile stabilire una diagnosi nei pazienti sui ventilatori che sviluppano febbre dopo operazioni neurochirurgiche.

Il fattore di crescita degli epatociti (HGF) è prodotto dalle cellule mesenchimali durante il danno d'organo. Viene prodotto come proteina precursore a catena singola e viene attivato nel sito della lesione mediante scissione della proteolisi, risultando in una forma attiva a doppia catena di HGF [4]. L'HGF attivo stimola la divisione cellulare [4] e la motilità cellulare e promuove la normale struttura morfogenica [5] nelle cellule epiteliali adiacenti alle aree lese. Pertanto, l'HGF induce la rigenerazione e la riparazione del tessuto danneggiato [6]. Alti livelli di HGF sistemico sono stati rilevati durante lesioni causate da infezione [7]. Nella meningite batterica, nella polmonite e nella gastroenterite batterica acuta, vi è una produzione locale di HGF nel sito di infezione [7-9]. L'HGF prodotto localmente durante l'infezione batterica è biologicamente attivo [10]. L'applicazione di HGF biologicamente attivo ha favorito la guarigione delle ulcere croniche delle gambe in uno studio pilota [11]. Una terapia antibiotica efficace riduce i livelli sistemici di HGF durante l'infezione [12-13]. L'HGF potrebbe essere considerato una proteina locale della fase acuta con proprietà curative [14].

La qualità del legame dell'HGF endogeno ai recettori può essere valutata con la risonanza plasmonica di superficie (SPR), una tecnica ottica appropriata per gli studi clinici che può determinare l'affinità di una proteina per diversi ligandi [15]. La valutazione basata su SPR dell'affinità di legame di HGF per i suoi recettori, c-Met ed eparan solfato proteoglicano (HSPG), potrebbe distinguere in modo rapido e sensibile le varianti di HGF con diverse attività biologiche [16-17].

Abbiamo precedentemente studiato la concentrazione di HGF nel CSF per i pazienti con meningite acquisita in comunità [7]. Abbiamo anche dimostrato che la presenza di HGF biologicamente attivo nel sito della lesione indica un'infiammazione locale acuta [18]. Durante un recente studio abbiamo valutato se le concentrazioni di HGF e l'affinità di legame di HGF per i suoi recettori potrebbero servire come marcatori per distinguere tra meningite associata a neurochirurgia e altre cause di infezione. Abbiamo determinato la concentrazione e l'affinità di legame dell'HGF in pazienti con meningite acquisita in comunità o meningite associata a neurochirurgia e abbiamo confrontato i risultati con i pazienti con malattia di Alzheimer o con i controlli con liquido cerebrospinale normale. Abbiamo dimostrato che la determinazione dell'HGF nel CSF potrebbe essere utilizzata come indicatore, complementare allo stato clinico e ai risultati di laboratorio di routine, per diagnosticare l'invasione batterica nel CSF in una fase precoce della malattia [18].

Il problema:

Caso clinico: una donna di 76 anni con pressione alta è stata trovata dai suoi vicini, priva di sensi, nel suo giardino il 28 ottobre 2009. La TAC ha rivelato un'emorragia subaracnoidea e la neuroangiografia ha rivelato 3 aneurismi. Viene ricoverata nel reparto di neurochirurgia e operata il 29 ottobre con drenaggio ventricolare e occlusione endovascolare degli aneurismi. È stata estubata dopo l'intervento, tuttavia soffriva di paralisi e stanchezza al braccio sinistro e alla gamba. Dal 30 ottobre ha avuto un basso grado di febbre e un leggero aumento della PCR e della procalcitonina. Il liquido cerebrospinale mostrava 170.000 globuli rossi e 630 globuli bianchi e lattato 5.8. La radiografia del torace ha mostrato una sospetta infiltrazione. Le colture di sangue e CSF sono state protette. Le colture prelevate dal 5 novembre hanno rivelato una crescita significativa di Enterobacter cloacae e Staphylococcus aurous nelle urine e una crescita di Staphylococcus aurous nel rinofaringe. Non ha ricevuto alcuna terapia antibiotica ei parametri sono diminuiti spontaneamente ma è continuato il basso grado di febbre. I globuli del CSF sono aumentati a 23000 globuli rossi e 106 globuli bianchi (11 novembre) e il lattato del CSF era 4,5 (drenaggio lombare). Sebbene la PCR fosse nel range normale, ha ricevuto meropenen 2 g x 3 in caso di sospetta meningite batterica. Per prima cosa il 19 novembre le colture di CSF prelevate l'11 novembre hanno rivelato la crescita di Propionibacterium acnes. Il regime antibiotico è proseguito fino al 23 novembre. Soffriva di disorientamento, stanchezza e aveva l'idrocefalo. Ha subito un'operazione di shunt il 23 novembre. Morì il 2 dicembre 2009. L'alta concentrazione di HGF e l'elevata affinità di legame per HSPG sono state rilevate nell'analisi del liquido cerebrospinale già il 2 novembre.

A causa delle difficoltà nello stabilire una diagnosi e della mancanza di standard aurei, i medici sono motivati ​​a trattare le infezioni sospette individualmente perché non esiste un metodo diagnostico in grado di identificare il focus delle infezioni in tempo. La PCR per il rilevamento del pannello batterico e del virus nel liquido cerebrospinale è un metodo sensibile. Tuttavia potrebbe rilevare anche i batteri colonizzati. La presenza di batteri non è la stessa cosa dell'infezione. Pertanto, nei casi di meningite batterica, in particolare dopo l'intervento chirurgico al cervello e per i corpi estranei che vengono inseriti nel cervello, non possiamo fare affidamento totalmente su colture positive o negative. Un metodo complementare (per i metodi standard disponibili in laboratorio) con un alto valore predittivo negativo aumenta la specificità dei test e riduce profondamente i costi, i tempi e le complicanze come le infezioni acquisite in ospedale (HAI).

Il Metodo, Metacromazia Inversa:

L'N-terminale di HGF (Hairpin Loop) è stato identificato come sito di legame sia per c-Met che per HSPG. Esiste un'alta correlazione tra il legame dell'HGF all'HSPG e al destrano solfato nel sistema SPR (fig 1). La metocromasia è un caratteristico cambiamento di colore che alcuni coloranti all'anilina mostrano quando sono legati a sostanze cromotropiche [19]. Questo fenomeno è stato ampiamente utilizzato nello studio delle sezioni di tessuto. Il blu di metilene (O-toluidina) è considerato un eccellente colorante metacromatico. Dopo il legame con polisaccaridi ad alto peso molecolare, come il solfato di destrano, il colore della soluzione dell'indicatore cambia da blu a rosso [19].

Combinazioni di destrano solfato e O-toluidina in proporzioni diverse producono soluzioni di colore rosso porpora di varia intensità. Le carte da filtro personalizzate patinate costituiscono le superfici che vengono posizionate su strisce. A contatto con soluzioni biologiche, il campione HGF sostituisce competitivamente l'O-toluidina per il legame con il destrano solfato e il colore della superficie ritorna al blu (Fig. 2). Questa piattaforma rileva la presenza di proteine ​​leganti l'HSPG come l'HGF nei fluidi corporei tra cui espettorante, urina, secrezioni ulcerose, liquido cerebrospinale e versamento articolare durante l'infezione. Elevate quantità di proteine ​​o pH elevato non provocano reazioni aspecifiche con questo dispositivo.

Il piano di studi:

Responsabile dello studio: Amir Ramezani

La procedura:

Campioni di liquor, urina ed espettorato (n=500) vengono raccolti da pazienti (1-99 anni) sottoposti a intervento chirurgico per tumore al cervello, emorragia intracerebrale, disfunzione dello shunt o frattura del cranio. I campioni vengono mantenuti congelati a -20° C fino all'esecuzione delle analisi. Non ci sono criteri di esclusione.

Controlla la malattia di Alzheimer (n=20)

• I campioni di CSF sono stati raccolti e mantenuti congelati da pazienti (N=20) a cui era stata diagnosticata la malattia di Alzheimer presso la Memory Clinic, Skåne University Hospital di Malmö. I criteri DSM-III e NINDS-ADRDA rivisti sono stati utilizzati per la diagnosi della demenza di Alzheimer (questo gruppo di studio è stato incluso in uno studio precedente).
• liquor normale
• Questo gruppo è composto da pazienti che hanno subito una puntura lombare per escludere la meningite e avevano un liquido cerebrospinale normale.
• Analisi dell'affinità di legame del ligando con risonanza plasmonica di superficie
• L'attività biologica di HGF viene analizzata con SPR. Misuriamo l'affinità di legame con HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e con una chimera ricombinante c-Met (sistemi di ricerca e sviluppo), come descritto in precedenza.
• Misurazioni delle concentrazioni di HGF nei campioni Per determinare le concentrazioni di HGF nel liquido cerebrospinale è stato utilizzato un kit ELISA (Quantikine Human HGF immunoassay, limite minimo rilevabile: 0,04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). espettorato e urina secondo le istruzioni del produttore. Tutte le misurazioni sono state eseguite con un lettore ELISA (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Austria) a 450 nm, che è stato calibrato con i campioni di riferimento HGF umani ricombinanti e gli standard forniti nel kit.
• Metacromazia inversa Il test della striscia di studio viene eseguito su tutti i campioni.
• Valutazioni di laboratorio di routine
• Il CSF viene analizzato per determinare i valori dei parametri presso i Dipartimenti di Chimica Clinica, Ospedali Universitari, a Linköping. Tutte le colture, i test PCR, i test di rilevamento dell'antigene e le valutazioni sierologiche vengono eseguiti presso il Dipartimento di Microbiologia, Ospedale universitario, Linköping, Svezia.
• Cellule CSF: eseguite mediante microscopia manuale a contrasto di fase (Zeiss) utilizzando la camera di Jessen per il conteggio del numero di eritrociti e leucociti (neutrofili polimorfonucleati e monociti).
• Lattato CSF: eseguito utilizzando l'emogasanalizzatore da banco ABL 800 (Radiometer Medical ApS Denmark).
• Rilevamento dell'antigene: l'antigene (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides gruppo A, gruppo B/Escherichia coli K1, gruppo C e gruppo Y/135, Streptococcus agalactiae) viene rilevato mediante il metodo di agglutinazione al lattice Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Francia) .
• Coltura CSF: eseguita in palloni aerobi e anaerobi nonché in piastre di ematina.
• Rilevamento del virus PCR: il virus dell'herpes di tipo 1 e 2 (HSV1, HSV 2) e il DNA dell'HZV sono stati rilevati mediante PCR. L'enterovirus umano (HEV) è stato analizzato da uno strumento automatizzato (Cepheid GeneXpert).
• analisi statistica
• Poiché i dati sulle concentrazioni di HGF e sull'affinità di legame non sono normalmente distribuiti, i test non parametrici Kruskal-Wallis test seguito dal test U di Mann-Whitney o dal test delle coppie appaiate di Wilcoxon sono appropriati per l'analisi. L'analisi delle prestazioni della prova deve essere eseguita manualmente.

Valutazione clinica della piattaforma in un gel contenente solfato di destrano Utilizzando l'approccio della metacromazia inversa abbiamo studiato un totale di 656 campioni di feci con La sensibilità, la specificità, il valore predittivo positivo e il valore predittivo negativo nonché l'accuratezza sono stati calcolati nei seguenti gruppi : gastroenterite infettiva verificata (n=207) e altre cause di diarrea, inclusa IBD (n=268). Il test è stato in grado di distinguere la gastroenterite infettiva acuta con una sensibilità del 96,6% e una specificità del 92,4%, un valore predittivo positivo del 90,9% e un valore predittivo negativo del 97,2%. L'accuratezza del test è stata del 94,3%. Non è stata trovata alcuna correlazione significativa tra i risultati del test e la calprotectina fecale (R2=0·056). Nessuna correlazione significativa è stata osservata tra i risultati del test indice e la presenza di sangue nelle feci (R2=0·08) [20].

Valutazione clinica dell'HGF come marcatore per distinguere la meningite settica da altre cause di pleiocitosi [18] La meningite settica acquisita in comunità ha mostrato una concentrazione di HGF significativamente più elevata (p=0,0133), così come l'affinità di legame dell'HGF con i recettori c-Met e HSPG (p=0,0007 e p=0,0009, rispettivamente) rispetto alla meningite nosocomiale. I campioni di CSF di pazienti con meningite settica (compresi sia acquisiti in comunità che nosocomiali) erano significativamente più alti nelle concentrazioni di HGF (p=0,0014), Legame di HGF a HSPG (p<0,0001) e legame di HGF a c-Met (p<0,0001) rispetto ai campioni di pazienti con meningite asettica (virale e sub acuta). I campioni di CSF di pazienti con meningite settica erano più alti nei campioni del gruppo di controllo (pazienti con CSF normale) e di pazienti con malattia di Alzheimer nella concentrazione di HGF (p<0,0001, p=0,0010, rispettivamente), legame di HGF a HSPG (p<0,0001 e p=0,9, rispettivamente) e legame di HGF a c-Met (entrambi p<0,0001).

Rispetto ai campioni di pazienti sottoposti a neurochirurgia e affetti da altre malattie infettive, i campioni di CSF di pazienti con meningite nosocomiale presentavano concentrazioni di HGF significativamente più elevate (p<0,0001) e affinità di legame dell'HGF con c-Met (p<0,0001) e HSPG (p= 0,043) recettori (Figura 3-4).

Legende delle figure Fig. 1. Sequenza di parte della catena α di HGF. I codoni ingranditi codificano per amminoacidi importanti per il legame a HSPG e al recettore c-Met.

Fig. 2. Il supporto teorico per il secondo approccio per un dispositivo per rilevare la presenza di HGF nei fluidi corporei durante un'infezione. (1) Catena polimerica del glucosaminoglicano (GAG) con cariche negative. (2) Le molecole TBO positive si attaccano alla catena polimerica, quindi vengono concentrate e formano pile. Il colore cambia dal blu al rosso. (3) Viene aggiunto un campione con HGF, che si lega a GAG. (4) Le pile di molecole TBO vengono distrutte e diventano molecole TBO liberamente dissolte. Il colore cambia dal rosso al blu.

Figura 3: Diagramma di flusso della selezione dei campioni di CSF dai gruppi di pazienti e di controllo. I campioni extra sono i campioni prelevati durante la degenza da pazienti con meningite nosocomiale.

Figura 4: Le proprietà dell'HGF derivate da diversi campioni di CSF sono state analizzate utilizzando il plasmon di superficie e le tecniche ELISA. (A) Legame ai recettori c-Met; (B) Legame ai recettori HSPG; (C) Concentrazioni di HGF (mediana). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

La rapida evoluzione e diffusione di batteri resistenti agli antimicrobici in parallelo con lo sviluppo insufficiente di nuovi farmaci attivi pregiudica seriamente la futura terapia antinfettiva delle infezioni batteriche, in particolare quelle dovute a bastoncini Gram-negativi. Gli esperti del settore stimano che entro il prossimo decennio il mondo sarà testimone dell'ampia diffusione di infezioni non curabili (o quasi non curabili), sia all'interno che all'esterno degli ospedali. Per evitare o almeno tentare di ritardare questa crisi, molti ricercatori hanno dedicato i loro sforzi a chiarire i fattori che favoriscono l'emergenza e la diffusione globale di batteri resistenti agli antimicrobici. Una strategia efficace per limitare l'insorgenza di più ceppi resistenti potrebbe includere la direzione della terapia antibiotica identificando i casi che dovrebbero o non dovrebbero essere trattati con antibiotici, evitando la somministrazione di antibiotici ad ampio spettro e promuovendo trattamenti più specifici.

Quello che serve è un test semplice, accurato, economico e fattibile che risponda a domande cruciali.

Al fine di valutare la rilevanza clinica e le prestazioni di tale test non esiste un ambiente migliore dell'assistenza sanitaria svedese che fornisce la valutazione pertinente e moderna delle malattie e la terapia basata sull'evidenza per quasi tutti i pazienti. Tale ambiente è un'opportunità per eseguire l'inclusione del paziente e la valutazione del test di studio rispetto agli strumenti standard più affidabili come colture, esami del sangue e raggi X. Queste risorse non sono automaticamente disponibili in nessun altro centro con tali proprietà affidabili, non commerciali e imparziali.

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