Rask test for påvisning av infeksjonsfokus hos postnevrokirurgiske pasienter.

Hepatocytt-vekstfaktor (HGF) er lokalt akuttfaseprotein med regenerative egenskaper som blir biologisk inaktivt under kronisk inflammasjon og mister bindingsaffiniteten til glykosaminoglykan i den ekstracellulære matrixen. HGF skilles ut i mage-tarmkanalen og oppdages ikke i normal urin. Nosokomial meningitt kan oppstå når hjernekirurgiske prosedyrer kompliseres av infeksjon. På grunn av underliggende CNS-sykdomsprosesser og CNS-enheter in situ, skiller de viktigste midlene for nosokomial bakteriell meningitt seg fra midlene for samfunnservervet meningitt. For eksempel, ved sykehusinfeksjoner, er saktevoksende, opportunistiske mikroorganismer dominerende. CSF-leukocyttprofilen påvirkes av intracerebral blødning, og CSF-laktat kan være forhøyet på grunn av iskemi. I tillegg kan endret bevissthet gjøre det vanskelig å stille en diagnose hos pasienter på respirator som utvikler feber etter nevrokirurgiske operasjoner. Det er med andre ord ofte vanskelig å fastslå om den skadde hjernen har blitt invadert av bakteriefloraen i miljøet.

På grunn av utfordringene med å etablere en diagnose, og mangelen på gullstandarder, er leger motivert til å behandle mistenkte infeksjoner ved alvorlige sykdommer med bredspektrede antibiotika. De nye problemene med multiple-resistensbakterier, høye kostnader og komplikasjoner knyttet til nye antibiotika har krevd diagnostiske tester som kan minimere antibiotikaforbruket.

Foreløpig forblir diagnosen bakteriell meningitt basert på standardmetoder for direkte mikroskopi, differensialanalyser av hvite blodceller, laktat og protein, og kulturer av blod og CSF. Post-nevrokirurgiske infeksjoner er imidlertid vanskelige å skille fra effektene av nevrokirurgiske prosedyrer. På grunn av profylaksebehandlinger er kulturene dessuten negative i en stor gruppe pasienter, og tilstedeværelsen av hudflora, som koagulase-negativ Staphylococcus eller Propionbacterium acnes, kan indikere enten infeksjon eller kontaminering. Overlevelse fra denne livstruende tilstanden avhenger av en rask diagnose og rask empirisk antibiotikabehandling designet for å dekke de sannsynlige patogenene.

Hvor er infeksjonsfokuset? Er det en bakteriell (septisk) meningitt? Er bredspektret antibiotikaadministrasjon indisert? Bakgrunnen for prosjektet: En invasjon av bakterier i sentralnervesystemet (CNS) etterfølges av en raskt utviklende inflammatorisk prosess som påvirker arachnoidrommet, pia mater og cerebrospinalvæsken (CSF). Denne tilstanden fører til kliniske symptomer på hodepine, feber og meningisme. Den inflammatoriske responsen er forårsaket av frigjøring av ulike pro-inflammatoriske cytokiner fra hjernehinneceller til subaraknoidalrommet. Som et resultat beveger nøytrofiler seg inn i subaraknoidalrommet og forårsaker pleocytose i CSF. Konsekvensene inkluderer nedbrytning av blod-hjerne-barrieren, cerebralt ødem, redusert cerebral blodstrøm, fokale områder av hypoperfusjon, vaskulær trombose, iskemi, forbedret glukosemetabolisme via den anaerobe glykolytiske banen og økt laktatakkumulering i hjernen og CSF [ 1]. Overlevelse fra denne livstruende tilstanden avhenger av en rask diagnose og rask empirisk antibiotikabehandling designet for å dekke de sannsynlige patogenene.

Andre årsaker til febril meningitt inkluderer akutt viral meningitt og ikke-pyogen meningitt, hvor det kliniske bildet typisk er subakutt eller kronisk. De diagnostiske prosedyrene består av en lumbalpunksjon for å analysere CSF for celler og bakterier, mikrobiologiske kulturer av blod og CSF, serologiske tester som involverer PCR og antigen-deteksjon, og radiografiske teknikker [2]. Ved fellesskapservervet meningitt kan en kombinasjon av diskriminerende verdier fra CSF-analysen skille akutt bakteriell meningitt fra andre, ikke-ambulatoriske årsaker med ganske høy sensitivitet [3].

Nosokomial meningitt kan oppstå når hjernekirurgiske prosedyrer kompliseres av infeksjon [2]. På grunn av underliggende CNS-sykdomsprosesser og CNS-enheter in situ, skiller de viktigste midlene for nosokomial bakteriell meningitt seg fra midlene for samfunnservervet meningitt. CSF-leukocyttprofilen påvirkes av intracerebral blødning, og CSF-laktat kan være forhøyet på grunn av iskemi. I tillegg kan endret bevissthet gjøre det vanskelig å stille en diagnose hos pasienter på respirator som utvikler feber etter nevrokirurgiske operasjoner.

Hepatocytt vekstfaktor (HGF) produseres av mesenkymale celler under organskade. Det produseres som et enkeltkjedet forløperprotein, og det aktiveres på skadestedet ved proteolysespaltning, noe som resulterer i en dobbeltkjedet aktiv form av HGF [4]. Aktiv HGF stimulerer celledeling [4] og cellemotilitet, og det fremmer normal morfogen struktur [5] i epitelceller ved siden av skadede områder. Dermed induserer HGF regenerering og gjenparring av skadet vev [6]. Høye nivåer av systemisk HGF er påvist under skader forårsaket av infeksjon [7]. Ved bakteriell meningitt, pneumoni og akutt bakteriell gastroenteritt er det lokal produksjon av HGF på infeksjonsstedet [7-9]. HGF produsert lokalt under bakteriell infeksjon er biologisk aktiv [10]. Bruk av biologisk aktiv HGF fremmet helbredelse av kroniske leggsår i en pilotstudie [11]. Effektiv antibiotikabehandling reduserer systemiske HGF-nivåer under infeksjon [12-13]. HGF kan betraktes som et lokalt akuttfaseprotein med helbredende egenskaper [14].

Kvaliteten på endogen HGF-binding til reseptorer kan vurderes med overflateplasmonresonans (SPR), en optisk teknikk som passer for kliniske studier som kan bestemme affiniteten til et protein for flere ligander [15]. SPR-basert vurdering av HGF-bindingsaffinitet for dets reseptorer, c-Met og heparansulfatproteoglykan (HSPG), kunne raskt og følsomt skille HGF-varianter med forskjellige biologiske aktiviteter [16-17].

Vi har tidligere studert konsentrasjonen av HGF i CSF for pasienter med samfunnservervet meningitt [7]. Vi har også vist at tilstedeværelsen av biologisk aktiv HGF på skadestedet indikerer en akutt lokal betennelse [18]. I løpet av en nylig studie har vi vurdert om HGF-konsentrasjoner og HGF-bindingsaffinitet for dets reseptorer kan tjene som markører for å skille mellom meningitt assosiert med nevrokirurgi og andre årsaker til infeksjon. Vi bestemte konsentrasjonen og bindingsaffiniteten til HGF hos pasienter med enten samfunnservervet meningitt eller nevrokirurgi-assosiert meningitt, og sammenlignet resultatene med enten pasienter med Alzheimers sykdom eller kontroller med normal CSF. Vi har vist at bestemmelse av HGF i CSF kan brukes som en indikator, komplementær til klinisk status og rutinemessige laboratoriefunn, for å diagnostisere bakteriell invasjon i CSF på et tidlig stadium av sykdom [18].

Problemet:

Saksrapport: 76 år gammel kvinne med høyt blodtrykk ble funnet av naboene bevisstløs i hagen sin 28. oktober 2009. CT-skanningen avdekket subaraknoidal blødning og nevro-angiografi avdekket 3 aneurismer. Hun ble innlagt ved nevrokirurgisk avdeling og operert 29. oktober med ventrikkeldrenasje og endovaskulær okklusjon av aneurismene. Hun ble ekstubert etter operasjonen, men hun led av lammelser i venstre arm og ben og tretthet. Siden 30. oktober hadde hun lav febergrad og noe økt CRP og prokalsitonin. Cerebrospinalvæske viste 170.000 røde og 630 hvite blodlegemer og laktat 5,8. Røntgen av thorax viste en mistenkt infiltrasjon. Blod- og CSF-kulturene ble sikret. Kulturene tatt fra 5. november avslørte betydelig vekst av Enterobacter cloacae og Staphylococcus aurous i urin og vekst av Staphylococcus aurous i nasopharynx. Hun fikk ingen antibiotikabehandling og parametrene sank spontant, men lav feber fortsatte. CSF-blodcellene økte til 23000 røde og 106 hvite blodceller (11. november), og CSF-laktat var 4,5 (lumbal drenasje). Selv om CRP var i normalområdet fikk hun meropenen 2g x 3 under mistanke om bakteriell meningitt. Først 19. november avslørte CSF-kulturene tatt 11. november vekst av Propionibacterium acnes. Antibiotikaregimet fortsatte til 23. november. Hun led av desorientering, tretthet og hadde hydrocephalus. Hun gjennomgikk shuntoperasjon 23. november. Hun døde 2. desember 2009. Høy konsentrasjon av HGF og forhøyet bindingsaffinitet til HSPG ble funnet i CSF-analyse allerede 2. november.

På grunn av utfordringene med å etablere en diagnose, og mangelen på gullstandarder, er leger motivert til å behandle mistenkte infeksjoner individuelt fordi det ikke finnes noen diagnostisk metode som kan identifisere infeksjonsfokuset i tide. PCR for bakteriepanel og virusdeteksjon i CSF er sensitiv metode. Imidlertid kan det også oppdage de koloniserte bakteriene. Tilstedeværelsen av bakterier er ikke det samme som infeksjon. Derfor i tilfeller av bakteriell meningitt, spesielt etter hjernekirurgi og fremmedlegemer som settes inn i hjernen, kan vi derfor ikke stole på positive eller negative kulturer helt. En komplementær metode (for standardmetodene som er tilgjengelige på laboratoriet) med høy negativ prediktiv verdi øker spesifisiteten til tester og reduserer kostnadene, tiden og komplikasjoner som sykehuservervede infeksjoner (HAI) betydelig.

Metoden, omvendt metachromati:

N-terminalen til HGF (Hairpin Loop) har blitt identifisert som bindingssetet til både c-Met og HSPG. Det er en høy korrelasjon mellom binding av HGF til HSPG og til dekstransulfat i SPR-systemet (fig 1). Metokromasi er en karakteristisk fargeendring som visse anilinfargestoffer viser når de bindes til kromotrope stoffer [19]. Dette fenomenet har vært mye brukt i studiet av vevssnitt. Metylenblått (O-toluidin) regnes som et utmerket metakromatisk fargestoff. Ved binding til polysakkarider med høy molekylvekt, slik som dekstransulfat, endres fargen på indikatorløsningen fra blå til rød [19].

Kombinasjoner av dekstransulfat og O-toluidin i forskjellige proporsjoner gir lilla-rødfargede løsninger av varierende intensitet. Bestrøket tilpasset filterpapir utgjør overflater som legges på strimler. Når den er i kontakt med biologiske løsninger, erstatter prøven HGF konkurrerende O-toluidin for binding til dekstransulfat og fargen på overflaten går tilbake til blå (fig 2). Denne plattformen detekterer tilstedeværelsen av HSPG-bindende proteiner som HGF i kroppsvæsker, inkludert slimløsende, urin, magesår, cerebrospinalvæske og leddeffusjon under infeksjon. Høye mengder protein eller høy pH forårsaker ikke uspesifikke reaksjoner med denne enheten.

Studieplanen:

Studieleder: Amir Ramezani

Prosedyren:

CSF-prøver, urin og sputum (n=500) tas fra pasienter (1-99 år) som har gjennomgått hjernetumorkirurgi, intracerebral blødning, shuntdysfunksjon eller hodeskallebrudd. Prøvene oppbevares frosset i -20°C inntil analyser ble utført. Det er ingen eksklusjonskriterier.

Kontrollerer Alzheimers sykdom (n=20)

• CSF-prøver ble samlet inn og oppbevart frosset fra pasienter (N=20) som ble diagnostisert med Alzheimers sykdom ved Minneklinikken, Skånes universitetssykehus i Malmö. De reviderte DSM-III- og NINDS-ADRDA-kriteriene ble brukt for diagnose av Alzheimers demens (denne studiegruppen har vært inkludert i tidligere studie).
• Normal CSF
• Denne gruppen består av pasienter som har gjennomgått lumbalpunksjon for å utelukke meningitt, og de hadde normal CSF.
• Analyse av ligandbindende affinitet med overflateplasmonresonans
• Den biologiske aktiviteten til HGF analyseres med SPR. Vi måler bindingsaffiniteten til HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og til en c-Met rekombinant kimær (FoU-systemer), som tidligere beskrevet.
• Målinger av HGF-konsentrasjoner i prøver Et spesifikt enzymkoblet immunosorbent-assay (ELISA)-sett (Quantikine Human HGF-immunoassay, minimum påvisbar grense: 0,04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) ble brukt for å bestemme HGF-konsentrasjoner i CSF, sputum og urin i henhold til produsentens anvisninger. Alle målinger ble utført med en ELISA-leser (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Østerrike) ved 450 nm, som ble kalibrert med de rekombinante humane HGF-referanseprøvene og standardene gitt i settet.
• Omvendt metakromati Studiestrimmeltesten utføres på alle prøver.
• Rutinemessige laboratorievurderinger
• CSF analyseres for å bestemme parameterverdier ved avdelingene for klinisk kjemi, universitetssykehusene i Linköping. Alle kulturer, PCR-analyser, antigendeteksjonsanalyser og serologiske vurderinger utføres ved Mikrobiologiavdelingen, Universitetssykehuset, Linköping, Sverige.
• CSF-celler: Utføres ved manuell fasekontrastmikroskopi (Zeiss) ved bruk av Jessen Chamber for telling av antall erytrocytter og leukocytter (polymorfonukleære nøytrofiler og monocytter).
• CSF-laktat: Utføres ved bruk av benchtop blodgassanalysator ABL 800 (Radiometer Medical ApS Danmark).
• Antigenpåvisning: Antigen (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides gruppe A, gruppe B/Escherichia coli K1, gruppe C og gruppe Y/135, Streptococcus agalactiae) påvises med lateksagglutinasjonsmetoden Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Frankrike) .
• CSF-kultur: Utføres i aerobe og anaerobe kolber samt i Hematin-plater.
• Virusdeteksjon PCR: Herpesvirus type 1 og 2 (HSV1, HSV 2) og HZV DNA ble påvist ved PCR. Human enterovirus (HEV) ble analysert med automatisert instrument (Cepheid GeneXpert).
• Statistisk analyse
• Fordi HGF-konsentrasjonene og bindingsaffinitetsdata ikke er normalfordelt, er ikke-parametriske tester Kruskal-Wallis-test etterfulgt av Mann-Whitney U-test eller Wilcoxon matchede par-test passende for analyse. Analysen av testytelsen skal utføres manuelt.

Klinisk evaluering av plattformen i en dekstransulfatholdig gel Ved å bruke omvendt metachromacy-tilnærming har vi studert totalt 656 fecesprøver med sensitivitet, spesifisitet, positiv prediktiv verdi og negativ prediktiv verdi samt nøyaktigheten ble beregnet i følgende grupper : verifisert infeksiøs gastroenteritt (n=207) og andre årsaker til diaré, inkludert IBD (n=268). Testen kunne skille akutt infeksiøs gastroenteritt med en sensitivitet på 96,6 % og spesifisitet 92,4 %, og en positiv prediktiv verdi på 90,9 % og negativ prediktiv verdi på 97,2 %. Nøyaktigheten av testen var 94,3 %. Det ble ikke funnet noen signifikant korrelasjon mellom testresultatene og feces calprotectin (R2=0·056). Det ble ikke observert noen signifikant sammenheng mellom resultatene av indekstesten og tilstedeværelsen av blod i feces (R2=0·08) [20].

Klinisk evaluering av HGF som en markør for å skille septisk meningitt fra andre årsaker til pleocytose [18] Den fellesskapservervede septiske meningitten viste signifikant høyere HGF-konsentrasjon (p=0,0133), samt HGF-bindingsaffinitet til c-Met- og HSPG-reseptorene (p=0,0007 og p=0,0009, henholdsvis) sammenlignet med nosokomial meningitt. CSF-prøver fra pasienter med septisk meningitt (inkludert både samfunnservervet og nosokomial) var signifikant høyere i HGF-konsentrasjoner (p=0,0014), HGF-binding til HSPG (p<0,0001), og HGF-binding til c-Met (p<0,0001) sammenlignet med prøver fra pasienter med aseptisk (viral og subakutt) meningitt. CSF-prøver fra pasienter med septisk meningitt var høyere fra prøver fra kontrollgruppen (pasienter med normal CSF) og fra pasienter med Alzheimers sykdom i HGF-konsentrasjon (p<0,0001, p=0,0010, henholdsvis HGF-binding til HSPG (henholdsvis p<0,0001 og p=0,9), og HGF-binding til c-Met (begge p<0,0001).

Sammenlignet med prøver fra pasienter som hadde gjennomgått nevrokirurgi og hadde andre infeksjonssykdommer, hadde CSF-prøver fra pasienter med nosokomial meningitt signifikant høyere HGF-konsentrasjoner (p<0,0001) og HGF-bindingsaffinitet til c-Met (p<0,0001) og HSPG (p= 0,043) reseptorer (Figur 3-4).

Figurforklaringer Fig. 1. Sekvens av en del av HGF a-kjeden. De forstørrede kodonene koder for aminosyrer som er viktige for binding til HSPG og c-Met-reseptoren.

Fig. 2. Den teoretiske støtten for den andre tilnærmingen for en enhet for å detektere tilstedeværelsen av HGF i kroppsvæsker under en infeksjon. (1) Glukosaminoglykan (GAG) polymerkjede med negative ladninger. (2) Positive TBO-molekyler fester seg til polymerkjeden og blir deretter konsentrert og danner stabler. Fargen endres fra blå til rød. (3) En prøve med HGF tilsettes, som binder seg til GAG. (4) TBO-molekylstabler blir ødelagt og blir fritt oppløste TBO-molekyler. Fargen endres fra rød til blå.

Figur 3: Flytskjema over utvalget av CSF-prøver fra pasient- og kontrollgrupper. Ekstraprøver er prøvene som tas under opphold på avdelingen fra pasienter med nosokomial meningitt.

Figur 4: Egenskapene til HGF avledet fra forskjellige CSF-prøver ble analysert ved bruk av overflateplasmon- og ELISA-teknikker. (A) Binding til c-Met-reseptorer; (B) Binding til HSPG-reseptorer; (C) HGF-konsentrasjoner (median). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

Den raske utviklingen og spredningen av antimikrobielle resistente bakterier parallelt med utilstrekkelig utvikling av nye aktive legemidler påvirker alvorlig fremtidig anti-infeksjonsterapi av bakterielle infeksjoner, spesielt de som skyldes Gram-negative staver. Eksperter på feltet anslår at i løpet av det neste tiåret vil verden ha vært vitne til den brede spredningen av ubehandlebare (eller nesten ubehandlebare) infeksjoner, både innenfor og utenfor sykehus. For å unngå eller i det minste forsøke å forsinke denne krisen, har mange forskere dedikert sin innsats for å belyse faktorer som favoriserer fremveksten og den globale spredningen av antimikrobielle resistente bakterier. En effektiv strategi for å begrense fremveksten av flere resistente stammer kan inkludere å styre antibiotikabehandlingen ved å identifisere tilfeller som bør eller ikke bør behandles med antibiotika, unngå bredspektret antibiotikaadministrasjon og fremme mer spesifikke behandlinger.

Det som trengs er en enkel, nøyaktig, kostnadseffektiv og gjennomførbar test som svarer på avgjørende spørsmål.

For å vurdere den kliniske relevansen og ytelsen til en slik test er det ikke et bedre miljø enn det svenske helsevesenet som gir relevant og moderne vurdering av sykdommer og evidensbasert terapi for nesten alle pasienter. Et slikt miljø er en mulighet til å utføre pasientinkludering og evaluering av studietesten i forhold til de mest pålitelige standardverktøyene som kulturer, blodprøver og røntgenbilder. Disse ressursene er ikke automatisk tilgjengelige i noe annet senter med slike pålitelige, ikke-kommersielle og upartiske egenskaper.

dnr 2015-429-32