Teste Rápido para Detecção de Foco de Infecção em Pacientes Pós Neurocirúrgicos.

O fator de crescimento de hepatócitos (HGF) é uma proteína local de fase aguda com propriedades regenerativas que se torna biologicamente inativa durante a inflamação crônica e perde a afinidade de ligação ao glicosaminoglicano na matriz extracelular. O HGF é excretado no trato gastrointestinal e não é detectado na urina normal. A meningite nosocomial pode ocorrer quando os procedimentos cirúrgicos cerebrais são complicados por infecção. Devido a processos subjacentes de doenças do SNC e dispositivos do SNC in situ, os principais agentes da meningite bacteriana nosocomial diferem dos agentes da meningite adquirida na comunidade. Por exemplo, em infecções nosocomiais, predominam microorganismos oportunistas de crescimento lento. O perfil de leucócitos do LCR é afetado pela hemorragia intracerebral, e o lactato do LCR pode estar elevado devido à isquemia. Além disso, a consciência alterada pode dificultar o diagnóstico em pacientes em ventiladores que desenvolvem febre após operações neurocirúrgicas. Em outras palavras, muitas vezes é difícil determinar se o cérebro lesado foi invadido pela flora bacteriana ambiental.

Devido aos desafios em estabelecer um diagnóstico e à falta de padrões de ouro, os médicos são motivados a tratar infecções suspeitas em doenças graves com antibióticos de amplo espectro. Os problemas emergentes de bactérias de resistência múltipla, altos custos e complicações relacionadas a novos antibióticos exigem testes diagnósticos que possam minimizar o consumo de antibióticos.

Atualmente, o diagnóstico de meningite bacteriana permanece baseado em métodos padronizados de microscopia direta, análises diferenciais de leucócitos, lactato e proteínas e culturas de sangue e LCR. No entanto, as infecções pós-neurocirúrgicas são difíceis de distinguir dos efeitos dos procedimentos neurocirúrgicos. Além disso, devido aos tratamentos profiláticos, as culturas são negativas em um grande grupo de pacientes, e a presença de flora cutânea, como Staphylococcus Coagulase negativo ou Propionbacterium acnes, pode indicar infecção ou contaminação. A sobrevivência a esta condição com risco de vida depende de um diagnóstico rápido e terapia antibiótica empírica imediata projetada para cobrir os patógenos prováveis.

Onde está o foco da infecção? É uma meningite bacteriana (séptica)? A administração de antibiótico de amplo espectro está indicada? Antecedentes do projeto: Uma invasão de bactérias no sistema nervoso central (SNC) é seguida por um processo inflamatório de evolução rápida que afeta o espaço aracnóide, a pia-máter e o líquido cefalorraquidiano (LCR). Essa condição leva a sintomas clínicos de cefaléia, febre e meningismo. A resposta inflamatória é causada pela liberação de várias citocinas pró-inflamatórias das células meníngeas no espaço subaracnóideo. Como resultado, os neutrófilos se movem para o espaço subaracnóideo e causam pleocitose no LCR. As consequências incluem a quebra da barreira hematoencefálica, edema cerebral, redução do fluxo sanguíneo cerebral, áreas focais de hipoperfusão, trombose vascular, isquemia, aumento do metabolismo da glicose através da via glicolítica anaeróbica e aumento do acúmulo de lactato no cérebro e no LCR. 1]. A sobrevivência a esta condição com risco de vida depende de um diagnóstico rápido e terapia antibiótica empírica imediata projetada para cobrir os patógenos prováveis.

Outras causas de meningite febril incluem meningite viral aguda e meningite não piogênica, onde o quadro clínico é tipicamente subagudo ou crônico. Os procedimentos diagnósticos consistem em uma punção lombar para analisar o LCR para células e bactérias, culturas microbiológicas de sangue e LCR, testes sorológicos envolvendo PCR e detecção de antígenos e técnicas radiográficas [2]. Na meningite adquirida na comunidade, uma combinação de valores discriminantes da análise do LCR pode diferenciar a meningite bacteriana aguda de outras causas não ambulatoriais com sensibilidade bastante alta [3].

A meningite nosocomial pode ocorrer quando os procedimentos cirúrgicos cerebrais são complicados por infecção [2]. Devido a processos subjacentes de doenças do SNC e dispositivos do SNC in situ, os principais agentes da meningite bacteriana nosocomial diferem dos agentes da meningite adquirida na comunidade. O perfil de leucócitos do LCR é afetado pela hemorragia intracerebral, e o lactato do LCR pode estar elevado devido à isquemia. Além disso, a consciência alterada pode dificultar o diagnóstico em pacientes em ventiladores que desenvolvem febre após operações neurocirúrgicas.

O fator de crescimento de hepatócitos (HGF) é produzido por células mesenquimais durante lesão de órgão. É produzido como uma proteína precursora de cadeia simples e é ativado no local da lesão por clivagem por proteólise, resultando em uma forma ativa de cadeia dupla de HGF [4]. O HGF ativo estimula a divisão celular [4] e a motilidade celular, e promove a estrutura morfogênica normal [5] nas células epiteliais adjacentes às áreas lesadas. Assim, o HGF induz a regeneração e reparação do tecido danificado [6]. Altos níveis de HGF sistêmico foram detectados durante lesões causadas por infecção [7]. Na meningite bacteriana, pneumonia e gastroenterite bacteriana aguda, há produção local de HGF no local da infecção [7-9]. O HGF produzido localmente durante a infecção bacteriana é biologicamente ativo [10]. A aplicação de HGF biologicamente ativo promoveu a cicatrização de úlceras crônicas de perna em um estudo piloto [11]. A antibioticoterapia eficaz reduz os níveis sistêmicos de HGF durante a infecção [12-13]. O HGF pode ser considerado como uma proteína local de fase aguda com propriedades cicatrizantes [14].

A qualidade da ligação endógena do HGF aos receptores pode ser avaliada com a ressonância de plasmon de superfície (SPR), uma técnica óptica apropriada para estudos clínicos que pode determinar a afinidade de uma proteína para vários ligantes [15]. A avaliação baseada em SPR da afinidade de ligação de HGF para seus receptores, c-Met e proteoglicano de sulfato de heparano (HSPG), pode distinguir rápida e sensivelmente variantes de HGF com diferentes atividades biológicas [16-17].

Nós estudamos anteriormente a concentração de HGF no LCR para pacientes com meningite adquirida na comunidade [7]. Também mostramos que a presença de HGF biologicamente ativo no local da lesão indica uma inflamação local aguda [18]. Durante um estudo recente, avaliamos se as concentrações de HGF e a afinidade de ligação do HGF para seus receptores podem servir como marcadores para distinguir entre meningite associada à neurocirurgia e outras causas de infecção. Determinamos a concentração e a afinidade de ligação do HGF em pacientes com meningite adquirida na comunidade ou meningite associada à neurocirurgia e comparamos os resultados com pacientes com doença de Alzheimer ou controles com LCR normal. Nós mostramos que a determinação de HGF no LCR pode ser usada como um indicador, complementar ao estado clínico e aos achados laboratoriais de rotina, para diagnosticar a invasão bacteriana no LCR em um estágio inicial da doença [18].

O problema:

Relato de caso: Mulher de 76 anos com pressão alta foi encontrada por seus vizinhos inconsciente em seu jardim em 28 de outubro de 2009. A tomografia computadorizada revelou hemorragia subaracnóidea e a neuroangiografia revelou 3 aneurismas. Foi internada no Serviço de Neurocirurgia e operada a 29 de Outubro com drenagem ventricular e oclusão endovascular dos aneurismas. Ela foi extubada após a cirurgia, mas sofria de paralisia e cansaço no braço e perna esquerdos. Desde 30 de outubro ela apresentava febre baixa e aumento leve de PCR e procalcitonina. O líquido cefalorraquidiano apresentou 170.000 glóbulos vermelhos e 630 glóbulos brancos e lactato 5,8. A radiografia de tórax mostrou uma infiltração suspeita. As culturas de sangue e LCR foram asseguradas. As culturas colhidas a partir de 5 de novembro revelaram crescimento significativo de Enterobacter cloacae e Staphylococcus aurous na urina e crescimento de Staphylococcus aurous na nasofaringe. Ela não recebeu terapia antibiótica e os parâmetros diminuíram espontaneamente, mas o baixo grau de febre continuou. Os glóbulos do LCR aumentaram para 23.000 glóbulos vermelhos e 106 glóbulos brancos (11 de novembro) e o lactato do LCR era de 4,5 (drenagem lombar). Embora a PCR estivesse na faixa normal, ela recebeu meropenen 2g x 3 sob suspeita de meningite bacteriana. Primeiro, em 19 de novembro, as culturas do LCR realizadas em 11 de novembro revelaram o crescimento de Propionibacterium acnes. O regime de antibióticos continuou até 23 de novembro. Ela sofria de desorientação, fadiga e hidrocefalia. Ela foi submetida a operação de derivação em 23 de novembro. Ela morreu em 2 de dezembro de 2009. Alta concentração de HGF e elevada afinidade de ligação ao HSPG foram encontradas na análise do LCR já em 2 de novembro.

Devido às dificuldades em estabelecer um diagnóstico e à falta de padrões-ouro, os médicos são motivados a tratar as infecções suspeitas individualmente, pois não existe um método diagnóstico que possa identificar o foco da infecção a tempo. PCR para painel bacteriano e detecção de vírus no LCR é um método sensível. No entanto, pode detectar as bactérias colonizadas também. A presença de bactérias não é o mesmo que infecção. Portanto, em casos de meningite bacteriana, especialmente após cirurgia cerebral e corpos estranhos inseridos no cérebro, não podemos confiar totalmente em culturas positivas ou negativas. Um método complementar (aos métodos padrão disponíveis em laboratório) com alto valor preditivo negativo aumenta a especificidade dos testes e diminui profundamente os custos, tempo e complicações como infecções hospitalares (IRAS).

O Método, Metacromacia Reversa:

O N-terminal de HGF (Hairpin Loop) foi identificado como o local de ligação para c-Met e HSPG. Existe uma alta correlação entre a ligação do HGF ao HSPG e ao sulfato de dextrana no sistema SPR (fig. 1). A metocromasia é uma alteração de cor característica que certos corantes de anilina exibem quando ligados a substâncias cromotrópicas [19]. Esse fenômeno tem sido amplamente utilizado no estudo de cortes de tecidos. O azul de metileno (O-toluidina) é considerado um excelente corante metacromático. Após a ligação a polissacarídeos de alto peso molecular, como sulfato de dextrana, a cor da solução indicadora muda de azul para vermelho [19].

Combinações de sulfato de dextrana e O-toluidina em diferentes proporções produzem soluções de cor vermelho-púrpura de intensidade variável. Papéis de filtro personalizados revestidos compõem superfícies que são colocadas em tiras. Quando em contato com soluções biológicas, o HGF da amostra substitui competitivamente a O-toluidina por se ligar ao sulfato de dextrana e a cor da superfície volta para azul (Fig. 2). Essa plataforma detecta a presença de proteínas de ligação ao HSPG, como HGF, em fluidos corporais, incluindo expectorante, urina, secreções de úlceras, líquido cefalorraquidiano e derrame articular durante a infecção. Altas quantidades de proteína ou pH alto não causam reações inespecíficas com este dispositivo.

O plano de estudos:

Líder do estudo: Amir Ramezani

O procedimento:

Amostras de CSF, urina e escarro (n=500) são coletadas de pacientes (1-99 anos de idade) que foram submetidos a cirurgia de tumor cerebral, hemorragia intracerebral, disfunção de shunt ou fratura de crânio. As amostras são mantidas congeladas a -20° C até que as análises sejam realizadas. Não há critérios de exclusão.

Controla a doença de Alzheimer (n=20)

• Amostras de LCR foram coletadas e mantidas congeladas de pacientes (N=20) que foram diagnosticados com a doença de Alzheimer na Memory Clinic, Skåne University Hospital em Malmö. Os critérios revisados ​​do DSM-III e NINDS-ADRDA foram usados ​​para o diagnóstico de demência de Alzheimer (este grupo de estudo foi incluído em estudo anterior).
• LCR normal
• Este grupo consiste em pacientes que foram submetidos a punção lombar para descartar meningite e apresentavam líquor normal.
• Análise da afinidade de ligação ao ligante com ressonância de plasmon de superfície
• A atividade biológica do HGF é analisada com SPR. Medimos a afinidade de ligação ao HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e a uma quimera recombinante c-Met (R&D Systems), conforme descrito anteriormente.
• Medições das concentrações de HGF em amostras Um kit específico de ensaio imunoenzimático (ELISA) (Quantikine Human HGF immunoassay, limite mínimo detectável: 0,04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) foi usado para determinar as concentrações de HGF no LCR, escarro e urina de acordo com as instruções do fabricante. Todas as medições foram realizadas com um leitor de ELISA (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Áustria) a 450 nm, que foi calibrado com as amostras de referência de HGF humano recombinante e os padrões fornecidos no kit.
• Metacromacia reversa O teste da tira de estudo é realizado em todas as amostras.
• Avaliações laboratoriais de rotina
• O CSF é analisado para determinar os valores dos parâmetros nos Departamentos de Química Clínica, Hospitais Universitários, em Linköping. Todas as culturas, ensaios de PCR, ensaios de detecção de antígenos e avaliações sorológicas são realizados no Departamento de Microbiologia, Hospital Universitário, Linköping, Suécia.
• CSF-cells: Realizado por microscopia manual de contraste de fase (Zeiss) usando Jessen Chamber para contagem do número de eritrócitos e leucócitos (neutrófilos polimorfonucleares e monócitos).
• Lactato no LCR: Realizado usando o analisador de gases sanguíneos de bancada ABL 800 (Radiometer Medical ApS Denmark).
• Detecção de antígeno: O antígeno (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides grupo A, grupo B/Escherichia coli K1, grupo C e grupo Y/135, Streptococcus agalactiae) é detectado pelo método de aglutinação de látex Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, França) .
• Cultura do LCR: Realizada em frascos de aeróbios e anaeróbios, bem como em placas de Hematina.
• Detecção de vírus PCR: Herpes vírus tipo 1 e 2 (HSV1, HSV 2) e HZV DNA foram detectados por PCR. O enterovírus humano (HEV) foi analisado por instrumento automatizado (Cepheid GeneXpert).
• Análise estatística
• Como as concentrações de HGF e os dados de afinidade de ligação não são normalmente distribuídos, testes não paramétricos, o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Mann-Whitney U ou o teste de pares combinados de Wilcoxon são apropriados para análise. A análise do desempenho do teste deve ser realizada manualmente.

Avaliação clínica da plataforma em um gel contendo sulfato de dextrana Usando a abordagem de metacromacia reversa, estudamos um total de 656 amostras de fezes com A sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo, bem como a precisão foram calculados nos seguintes grupos : gastroenterite infecciosa verificada (n=207) e outras causas de diarreia, incluindo DII (n=268). O teste pode distinguir gastroenterite infecciosa aguda com uma sensibilidade de 96,6% e especificidade de 92,4%, e um valor preditivo positivo de 90,9% e valor preditivo negativo de 97,2%. A precisão do teste foi de 94,3%. Não foi encontrada correlação significativa entre os resultados do teste e a calprotectina fecal (R2=0·056). Não foi observada correlação significativa entre os resultados do teste índice e a presença de sangue nas fezes (R2=0·08) [20].

Avaliação clínica do HGF como um marcador para distinguir a meningite séptica de outras causas de pleocitose (p=0,0007 ep=0,0009, respectivamente) em relação à meningite nosocomial. As amostras de LCR de pacientes com meningite séptica (incluindo adquirida na comunidade e nosocomial) foram significativamente maiores nas concentrações de HGF (p = 0,0014), Ligação de HGF a HSPG (p<0,0001) e ligação de HGF a c-Met (p<0,0001) em comparação com amostras de pacientes com meningite asséptica (viral e subaguda). As amostras de LCR de pacientes com meningite séptica foram maiores em amostras do grupo controle (pacientes com LCR normal) e de pacientes com doença de Alzheimer na concentração de HGF (p<0,0001, p=0,0010, respectivamente), ligação de HGF a HSPG (p<0,0001 ep=0,9, respectivamente) e ligação de HGF a c-Met (ambos p<0,0001).

Em comparação com amostras de pacientes submetidos a neurocirurgia e com outras doenças infecciosas, as amostras de LCR de pacientes com meningite nosocomial apresentaram concentrações de HGF significativamente maiores (p<0,0001) e afinidade de ligação de HGF a c-Met (p<0,0001) e HSPG (p= 0,043) receptores (Figura 3-4).

Legendas das Figuras Fig. 1. Sequência de parte da cadeia α do HGF. Os códons ampliados codificam aminoácidos importantes para a ligação ao HSPG e ao receptor c-Met.

Fig. 2. O suporte teórico para a segunda abordagem de um dispositivo para detectar a presença de HGF em fluidos corporais durante uma infecção. (1) Cadeia polimérica de glucosaminoglicano (GAG) com cargas negativas. (2) Moléculas positivas de TBO ligam-se à cadeia polimérica e então se concentram e formam pilhas. A cor muda de azul para vermelho. (3) Adiciona-se uma amostra com HGF, que se liga a GAG. (4) As pilhas de moléculas de TBO são destruídas e se tornam moléculas de TBO livremente dissolvidas. A cor muda de vermelho para azul.

Figura 3: Fluxograma da seleção de amostras de LCR dos grupos de pacientes e controle. Amostras extras são as amostras coletadas durante a internação de pacientes com meningite nosocomial.

Figura 4: As propriedades de HGF derivadas de diferentes amostras de CSF foram analisadas usando técnicas de plasmon de superfície e ELISA. (A) Ligação aos receptores c-Met; (B) Ligação a receptores HSPG; (C) Concentrações de HGF (mediana). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

A rápida evolução e disseminação de bactérias resistentes a antimicrobianos em paralelo com o desenvolvimento insuficiente de novas drogas ativas afetam seriamente a futura terapia anti-infecciosa de infecções bacterianas, especialmente aquelas causadas por bastonetes Gram-negativos. Especialistas na área estimam que, na próxima década, o mundo terá testemunhado a ampla disseminação de infecções intratáveis ​​(ou quase intratáveis), dentro e fora dos hospitais. Para evitar ou pelo menos tentar retardar essa crise, muitos pesquisadores têm dedicado esforços para elucidar os fatores que favorecem o surgimento e a disseminação global de bactérias resistentes aos antimicrobianos. Uma estratégia eficaz para limitar o surgimento de cepas multirresistentes pode incluir o direcionamento da antibioticoterapia, identificando os casos que devem ou não ser tratados com antibióticos, evitando a administração de antibióticos de amplo espectro e promovendo tratamentos mais específicos.

O que é necessário é um teste simples, preciso, econômico e viável que responda a perguntas cruciais.

Para avaliar a relevância clínica e o desempenho de tal teste, não há ambiente melhor do que o sistema de saúde sueco, que fornece avaliação relevante e moderna de doenças e terapia baseada em evidências para quase todos os pacientes. Tal ambiente é uma oportunidade para realizar a inclusão do paciente e avaliação do teste de estudo em comparação com as ferramentas padrão mais confiáveis, como culturas, exames de sangue e raios-X. Esses recursos não estão disponíveis automaticamente em nenhum outro centro com propriedades tão confiáveis, não comerciais e imparciais.

dnr 2015-429-32