Szybki test do wykrywania ogniska zakażenia u pacjentów po operacjach neurochirurgicznych.

Czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) jest miejscowym białkiem ostrej fazy o właściwościach regeneracyjnych, które w czasie przewlekłego stanu zapalnego staje się nieaktywne biologicznie i traci powinowactwo do glikozoaminoglikanu w macierzy pozakomórkowej. HGF jest wydalany z przewodu pokarmowego i nie jest wykrywany w normalnym moczu. Szpitalne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych może wystąpić, gdy zabiegi chirurgiczne mózgu są skomplikowane przez infekcję. Ze względu na podstawowe procesy chorobowe OUN i urządzenia OUN in situ, główne czynniki szpitalnego bakteryjnego zapalenia opon mózgowych różnią się od czynników pozaszpitalnego zapalenia opon mózgowych. Na przykład w zakażeniach szpitalnych dominują wolno rosnące mikroorganizmy oportunistyczne. Krwotok śródmózgowy ma wpływ na profil leukocytów w płynie mózgowo-rdzeniowym, a mleczan w płynie mózgowo-rdzeniowym może być podwyższony z powodu niedokrwienia. Ponadto zmieniona świadomość może utrudniać postawienie diagnozy u pacjentów podłączonych do respiratorów, u których po operacjach neurochirurgicznych wystąpiła gorączka. Innymi słowy, często trudno jest określić, czy uszkodzony mózg został zaatakowany przez środowiskową florę bakteryjną.

Ze względu na trudności w ustaleniu diagnozy i brak „złotych standardów” lekarze są zmotywowani do leczenia podejrzeń infekcji w poważnych chorobach za pomocą antybiotyków o szerokim spektrum działania. Pojawiające się problemy bakterii wieloopornych, wysokie koszty i powikłania związane z nowymi antybiotykami spowodowały konieczność badań diagnostycznych, które mogą zminimalizować zużycie antybiotyków.

Obecnie diagnostyka bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych nadal opiera się na standardowych metodach mikroskopii bezpośredniej, analizie różnicowej krwinek białych, mleczanu i białka oraz posiewach krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego. Jednak zakażenia poneurochirurgiczne są trudne do odróżnienia od skutków zabiegów neurochirurgicznych. Ponadto, w wyniku zabiegów profilaktycznych, posiewy u dużej grupy pacjentów są ujemne, a obecność flory skórnej, np. Przeżycie z tego zagrażającego życiu stanu zależy od szybkiej diagnozy i szybkiej empirycznej antybiotykoterapii mającej na celu pokrycie prawdopodobnych patogenów.

Gdzie jest ognisko infekcji? Czy to bakteryjne (septyczne) zapalenie opon mózgowych? Czy wskazane jest podanie antybiotyku o szerokim spektrum działania? Tło projektu: Po inwazji bakterii do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) następuje szybko rozwijający się proces zapalny, który wpływa na przestrzeń pajęczynówki, oponę miękką i płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF). Ten stan prowadzi do klinicznych objawów bólu głowy, gorączki i zapalenia opon mózgowych. Odpowiedź zapalna jest spowodowana uwalnianiem różnych cytokin prozapalnych z komórek oponowych do przestrzeni podpajęczynówkowej. W rezultacie neutrofile przemieszczają się do przestrzeni podpajęczynówkowej i powodują pleocytozę w płynie mózgowo-rdzeniowym. Konsekwencje obejmują przerwanie bariery krew-mózg, obrzęk mózgu, zmniejszony mózgowy przepływ krwi, ogniskowe obszary hipoperfuzji, zakrzepicę naczyń, niedokrwienie, wzmożony metabolizm glukozy na drodze glikolizy beztlenowej oraz wzmożoną akumulację mleczanu w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym. 1]. Przeżycie z tego zagrażającego życiu stanu zależy od szybkiej diagnozy i szybkiej empirycznej antybiotykoterapii mającej na celu pokrycie prawdopodobnych patogenów.

Inne przyczyny gorączkowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych obejmują ostre wirusowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i nieropotwórcze zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, gdzie obraz kliniczny jest zwykle podostry lub przewlekły. Procedury diagnostyczne obejmują nakłucie lędźwiowe w celu analizy płynu mózgowo-rdzeniowego w kierunku komórek i bakterii, posiewy mikrobiologiczne krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego, testy serologiczne obejmujące PCR i wykrywanie antygenów oraz techniki radiograficzne [2]. W pozaszpitalnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych kombinacja wartości różnicujących z analizy płynu mózgowo-rdzeniowego może z dość dużą czułością odróżnić ostre bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych od innych, niezwiązanych z chodzeniem przyczyn [3].

Szpitalne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych może wystąpić, gdy zabiegi chirurgiczne mózgu są powikłane infekcją [2]. Ze względu na podstawowe procesy chorobowe OUN i urządzenia OUN in situ, główne czynniki szpitalnego bakteryjnego zapalenia opon mózgowych różnią się od czynników pozaszpitalnego zapalenia opon mózgowych. Na profil leukocytów płynu mózgowo-rdzeniowego wpływa krwotok śródmózgowy, a mleczan w płynie mózgowo-rdzeniowym może być podwyższony z powodu niedokrwienia. Ponadto zmieniona świadomość może utrudniać postawienie diagnozy u pacjentów podłączonych do respiratorów, u których po operacjach neurochirurgicznych wystąpiła gorączka.

Czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) jest wytwarzany przez komórki mezenchymalne podczas uszkodzenia narządu. Jest wytwarzany jako jednołańcuchowe białko prekursorowe i jest aktywowany w miejscu uszkodzenia przez cięcie proteolityczne, w wyniku czego powstaje dwułańcuchowa aktywna postać HGF [4]. Aktywny HGF stymuluje podział komórek [4] i ruchliwość komórek oraz promuje prawidłową strukturę morfogeniczną [5] w komórkach nabłonka przylegających do uszkodzonych obszarów. W ten sposób HGF indukuje regenerację i naprawę uszkodzonej tkanki [6]. Wysoki poziom ogólnoustrojowego HGF wykryto podczas urazów spowodowanych infekcją [7]. W bakteryjnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych, zapaleniu płuc i ostrym bakteryjnym zapaleniu żołądka i jelit dochodzi do miejscowej produkcji HGF w miejscu zakażenia [7-9]. HGF wytwarzany lokalnie podczas infekcji bakteryjnej jest aktywny biologicznie [10]. Zastosowanie biologicznie czynnego HGF sprzyjało gojeniu przewlekłych owrzodzeń podudzi w badaniu pilotażowym [11]. Skuteczna antybiotykoterapia obniża ogólnoustrojowe stężenie HGF w trakcie infekcji [12-13]. HGF można uznać za miejscowe białko ostrej fazy o właściwościach leczniczych [14].

Jakość wiązania endogennego HGF z receptorami można ocenić za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), techniki optycznej odpowiedniej do badań klinicznych, w której można określić powinowactwo białka do kilku ligandów [15]. Oparta na SPR ocena powinowactwa wiązania HGF do jego receptorów, c-Met i proteoglikanu siarczanu heparanu (HSPG), może szybko i z dużą czułością rozróżnić warianty HGF o różnych aktywnościach biologicznych [16-17].

Wcześniej badaliśmy stężenie HGF w płynie mózgowo-rdzeniowym u pacjentów z pozaszpitalnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych [7]. Wykazaliśmy również, że obecność biologicznie czynnego HGF w miejscu urazu wskazuje na ostry miejscowy stan zapalny [18]. Podczas niedawnego badania oceniliśmy, czy stężenia HGF i powinowactwo wiązania HGF do jego receptorów mogą służyć jako markery do odróżnienia zapalenia opon mózgowych związanego z neurochirurgią od innych przyczyn infekcji. Określiliśmy stężenie i powinowactwo wiązania HGF u pacjentów z pozaszpitalnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych lub zapaleniem opon mózgowych związanych z neurochirurgią i porównaliśmy wyniki z pacjentami z chorobą Alzheimera lub grupą kontrolną z prawidłowym płynem mózgowo-rdzeniowym. Wykazaliśmy, że oznaczenie HGF w płynie mózgowo-rdzeniowym może być wskaźnikiem, uzupełniającym stan kliniczny i rutynowe wyniki badań laboratoryjnych, w diagnostyce inwazji bakteryjnej do płynu mózgowo-rdzeniowego we wczesnym stadium choroby [18].

Problem:

Opis przypadku: 76-letnia kobieta z nadciśnieniem została znaleziona przez sąsiadów nieprzytomną w swoim ogrodzie 28 października 2009 roku. Tomografia komputerowa wykazała krwawienie podpajęczynówkowe, a neuroangiografia wykazała 3 tętniaki. Została przyjęta na Oddział Neurochirurgii i operowana 29 października z drenażem komór i wewnątrznaczyniowym zamknięciem tętniaków. Po operacji została ekstubowana, jednak cierpiała na paraliż lewej ręki i nogi oraz zmęczenie. Od 30 października miała niską gorączkę i nieznacznie podwyższone CRP i prokalcytoninę. Płyn mózgowo-rdzeniowy wykazał 170 000 krwinek czerwonych i 630 krwinek białych oraz mleczan 5,8. Rentgen klatki piersiowej wykazał podejrzany naciek. Zabezpieczono hodowle krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego. Posiewy pobrane od 5 listopada wykazały znaczny wzrost Enterobacter cloacae i Staphylococcus aurous w moczu oraz wzrost Staphylococcus aurous w nosogardzieli. Nie otrzymała antybiotykoterapii, parametry samoistnie się obniżyły, ale utrzymywała się niska gorączka. Liczba komórek krwi w płynie mózgowo-rdzeniowym wzrosła do 23 000 czerwonych i 106 białych krwinek (11 listopada), a mleczan płynu mózgowo-rdzeniowego wynosił 4,5 (drenaż lędźwiowy). Chociaż CRP było w normie, otrzymała meropenen 2 g x 3 z podejrzeniem bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Najpierw 19 listopada posiew płynu mózgowo-rdzeniowego pobrany 11 listopada wykazał wzrost Propionibacterium Acnes. Reżim antybiotykowy trwał do 23 listopada. Cierpiała na dezorientację, zmęczenie i miała wodogłowie. 23 listopada przeszła operację zastawki. Zmarła 2 grudnia 2009 r. Już 2 listopada w analizie płynu mózgowo-rdzeniowego stwierdzono wysokie stężenie HGF i podwyższone powinowactwo wiązania z HSPG.

Ze względu na trudności w ustaleniu rozpoznania i brak „złotych standardów” lekarze są zmotywowani do indywidualnego leczenia podejrzeń infekcji, ponieważ nie ma metody diagnostycznej, która pozwoliłaby zidentyfikować ognisko infekcji w czasie. PCR do panelu bakteryjnego i wykrywania wirusów w płynie mózgowo-rdzeniowym jest metodą czułą. Jednak może również wykryć skolonizowane bakterie. Obecność bakterii to nie to samo co infekcja. Dlatego w przypadku bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, zwłaszcza po operacji mózgu i obecności ciał obcych w mózgu, nie możemy całkowicie polegać na posiewach dodatnich lub ujemnych. Metoda komplementarna (w stosunku do standardowych metod dostępnych w laboratorium) o wysokiej wartości predykcyjnej ujemnej zwiększa specyficzność badań i znacznie zmniejsza koszty, czas i powikłania, takie jak zakażenia szpitalne (HAI).

Metoda, odwrócona metachromacja:

N-koniec HGF (pętla spinki do włosów) został zidentyfikowany jako miejsce wiązania zarówno c-Met, jak i HSPG. Istnieje silna korelacja między wiązaniem HGF z HSPG i siarczanem dekstranu w układzie SPR (ryc. 1). Metochromazja to charakterystyczna zmiana koloru, którą wykazują niektóre barwniki anilinowe po związaniu z substancjami chromotropowymi [19]. Zjawisko to jest szeroko stosowane w badaniach skrawków tkanek. Błękit metylenowy (O-toluidyna) jest uważany za doskonały barwnik metachromatyczny. Po związaniu z polisacharydami o dużej masie cząsteczkowej, takimi jak siarczan dekstranu, kolor roztworu wskaźnika zmienia się z niebieskiego na czerwony [19].

Kombinacje siarczanu dekstranu i O-toluidyny w różnych proporcjach dają purpurowo-czerwone roztwory o różnej intensywności. Powlekane, dostosowane do potrzeb klienta bibuły filtracyjne tworzą powierzchnie, które są umieszczane na paskach. Próbka HGF w kontakcie z roztworami biologicznymi zastępuje konkurencyjnie O-toluidynę w wiązaniu z siarczanem dekstranu, a kolor powierzchni powraca do koloru niebieskiego (ryc. 2). Ta platforma wykrywa obecność białek wiążących HSPG, takich jak HGF, w płynach ustrojowych, w tym w środkach wykrztuśnych, moczu, wydzielinach wrzodowych, płynie mózgowo-rdzeniowym i wysięku stawowym podczas infekcji. Duże ilości białka lub wysokie pH nie powodują niespecyficznych reakcji z tym urządzeniem.

Plan nauki:

Kierownik badania: Amir Ramezani

Procedura:

Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego, moczu i plwociny (n=500) pobiera się od pacjentów (w wieku 1-99 lat), którzy przeszli operację guza mózgu, krwotok śródmózgowy, dysfunkcję przecieku lub złamanie czaszki. Próbki przechowuje się w stanie zamrożenia w temperaturze -20°C do czasu wykonania analiz. Nie ma kryteriów wykluczenia.

Kontroluje chorobę Alzheimera (n=20)

• Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego zebrano i przechowywano w stanie zamrożenia od pacjentów (N=20), u których zdiagnozowano chorobę Alzheimera w Klinice Pamięci Szpitala Uniwersyteckiego Skåne w Malmö. Zrewidowane kryteria DSM-III i NINDS-ADRDA zastosowano do rozpoznania otępienia typu alzheimerowskiego (tę grupę badaną uwzględniono w poprzednim badaniu).
• Normalny płyn mózgowo-rdzeniowy
• Ta grupa składa się z pacjentów, którzy przeszli nakłucie lędźwiowe w celu wykluczenia zapalenia opon mózgowych i mieli prawidłowy płyn mózgowo-rdzeniowy.
• Analiza powinowactwa wiązania ligandu z powierzchniowym rezonansem plazmonowym
• Aktywność biologiczną HGF analizuje się za pomocą SPR. Mierzymy powinowactwo wiązania z HSPG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i z rekombinowaną chimerą c-Met (R&D Systems), jak opisano wcześniej.
• Pomiary stężeń HGF w próbkach Do oznaczenia stężeń HGF w płynie mózgowo-rdzeniowym wykorzystano zestaw do swoistego testu immunoenzymatycznego (ELISA) (Quantikine Human HGF immunoassay, minimalna wykrywalna granica: 0,04 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), plwocina i mocz zgodnie z zaleceniami producenta. Wszystkie pomiary przeprowadzono za pomocą czytnika ELISA (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Austria) przy 450 nm, który skalibrowano z próbkami referencyjnymi rekombinowanego ludzkiego HGF i standardami dostarczonymi w zestawie.
• Metachromacja odwrotna Test paskowy przeprowadza się na wszystkich próbkach.
• Rutynowe oceny laboratoryjne
• Płyn mózgowo-rdzeniowy jest analizowany w celu określenia wartości parametrów na Oddziałach Chemii Klinicznej Szpitali Uniwersyteckich w Linköping. Wszystkie hodowle, testy PCR, testy wykrywania antygenów i oceny serologiczne są wykonywane na Wydziale Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego w Linköping w Szwecji.
• Komórki płynu mózgowo-rdzeniowego: Przeprowadzono za pomocą ręcznej mikroskopii z kontrastem fazowym (Zeiss) z użyciem komory Jessena do zliczania liczby erytrocytów i leukocytów (neutrofili wielojądrzastych i monocytów).
• Mleczan płynu mózgowo-rdzeniowego: Wykonywany za pomocą laboratoryjnego analizatora gazometrii krwi ABL 800 (Radiometer Medical ApS Denmark).
• Wykrywanie antygenu: Antygen (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides grupa A, grupa B/Escherichia coli K1, grupa C i grupa Y/135, Streptococcus agalactiae) jest wykrywany metodą aglutynacji lateksowej Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Francja) .
• Hodowla płynu mózgowo-rdzeniowego: Przeprowadzana w kolbach tlenowych i beztlenowych oraz na płytkach z hematyną.
• Wykrywanie wirusa PCR: Wirus opryszczki typu 1 i 2 (HSV1, HSV 2) oraz DNA HZV wykryto metodą PCR. Ludzki enterowirus (HEV) analizowano za pomocą automatycznego instrumentu (Cepheid GeneXpert).
• Analiza statystyczna
• Ponieważ dane dotyczące stężeń HGF i powinowactwa wiązania nie mają rozkładu normalnego, do analizy odpowiednie są testy nieparametryczne, test Kruskala-Wallisa, a następnie test U Manna-Whitneya lub test par Wilcoxona. Analizę wydajności testu przeprowadza się ręcznie.

Ocena kliniczna platformy w żelu zawierającym siarczan dekstranu Za pomocą metody odwróconej metachromacji zbadaliśmy łącznie 656 próbek kału z czułością, swoistością, pozytywną wartością predykcyjną i ujemną wartością predykcyjną, a także dokładnością obliczono w następujących grupach : zweryfikowane zakaźne zapalenie żołądka i jelit (n=207) oraz inne przyczyny biegunki, w tym IBD (n=268). Test pozwalał na rozróżnienie ostrego zakaźnego zapalenia żołądka i jelit z czułością 96,6% i swoistością 92,4% oraz dodatnią wartością predykcyjną 90,9% i ujemną wartością predykcyjną 97,2%. Dokładność testu wyniosła 94,3%. Nie stwierdzono istotnej korelacji między wynikami badań a kalprotektyną w kale (R2=0,056). Nie zaobserwowano istotnej korelacji między wynikami testu wskaźnikowego a obecnością krwi w kale (R2=0,08) [20].

Kliniczna ocena HGF jako markera odróżniającego septyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych od innych przyczyn pleocytozy [18] Pozaszpitalne septyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych wykazało istotnie wyższe stężenie HGF (p=0,0133), jak również powinowactwo wiązania HGF z receptorami c-Met i HSPG (odpowiednio p=0,0007 i p=0,0009) w porównaniu ze szpitalnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów z septycznym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych (w tym pozaszpitalnym i szpitalnym) miały istotnie wyższe stężenia HGF (p=0,0014), Wiązanie HGF z HSPG (p<0,0001) i wiązanie HGF z c-Met (p<0,0001) w porównaniu z próbkami pobranymi od pacjentów z aseptycznym (wirusowym i podostrym) zapaleniem opon mózgowych. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów z septycznym zapaleniem opon mózgowych były wyższe w porównaniu z próbkami z grupy kontrolnej (pacjenci z prawidłowym płynem mózgowo-rdzeniowym) oraz od pacjentów z chorobą Alzheimera w stężeniu HGF (p<0,0001, odpowiednio p=0,0010), wiązanie HGF z HSPG (odpowiednio p<0,0001 i p=0,9) i wiązanie HGF z c-Met (oba p<0,0001).

W porównaniu z próbkami pobranymi od pacjentów, którzy przeszli operację neurochirurgiczną i mieli inne choroby zakaźne, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów ze szpitalnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych miały znacznie wyższe stężenia HGF (p<0,0001) i powinowactwo wiązania HGF z c-Met (p<0,0001) i HSPG (p= 0,043) receptory (ryc. 3-4).

Legenda rysunku Ryc. 1. Sekwencja części łańcucha α HGF. Powiększone kodony kodują aminokwasy ważne dla wiązania się z HSPG i receptorem c-Met.

Ryc. 2. Teoretyczne uzasadnienie drugiego podejścia do urządzenia do wykrywania obecności HGF w płynach ustrojowych podczas infekcji. (1) Łańcuch polimerowy glukozaminoglikanu (GAG) z ładunkami ujemnymi. (2) Dodatnie cząsteczki TBO przyczepiają się do łańcucha polimeru, a następnie są skoncentrowane i tworzą stosy. Kolor zmienia się z niebieskiego na czerwony. (3) Dodaje się próbkę z HGF, który wiąże się z GAG. (4) Stosy cząsteczek TBO są niszczone i stają się swobodnie rozpuszczonymi cząsteczkami TBO. Kolor zmienia się z czerwonego na niebieski.

Rycina 3: Schemat wyboru próbek płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów i grup kontrolnych. Próbki dodatkowe to próbki pobrane podczas pobytu na oddziale od pacjentów ze szpitalnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych.

Figura 4: Właściwości HGF pochodzącego z różnych próbek płynu mózgowo-rdzeniowego analizowano stosując techniki plazmonu powierzchniowego i ELISA. (A) Wiązanie z receptorami c-Met; (B) Wiązanie z receptorami HSPG; (C) Stężenia HGF (mediana). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.

Gwałtowna ewolucja i rozprzestrzenianie się bakterii opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe przy równoczesnym niewystarczającym opracowaniu nowych leków aktywnych poważnie wpływa na przyszłą terapię przeciwinfekcyjną zakażeń bakteryjnych, zwłaszcza wywołanych przez pałeczki Gram-ujemne. Eksperci w tej dziedzinie szacują, że w ciągu następnej dekady świat będzie świadkiem szerokiego rozpowszechnienia nieuleczalnych (lub prawie nieuleczalnych) infekcji, zarówno w szpitalach, jak i poza nimi. Aby uniknąć lub przynajmniej próbować opóźnić ten kryzys, wielu badaczy poświęciło swoje wysiłki wyjaśnieniu czynników sprzyjających powstawaniu i globalnemu rozprzestrzenianiu się bakterii opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe. Skuteczna strategia ograniczania pojawiania się wielu opornych szczepów może obejmować ukierunkowanie antybiotykoterapii poprzez identyfikację przypadków, które powinny lub nie powinny być leczone antybiotykami, unikanie podawania antybiotyków o szerokim spektrum działania i promowanie bardziej specyficznych metod leczenia.

Potrzebny jest prosty, dokładny, opłacalny i wykonalny test, który odpowie na kluczowe pytania.

Nie ma lepszego środowiska do oceny przydatności klinicznej i skuteczności takiego testu niż szwedzka służba zdrowia, która zapewnia odpowiednią i nowoczesną ocenę chorób i terapię opartą na dowodach dla prawie wszystkich pacjentów. Takie środowisko daje możliwość włączenia pacjenta i oceny badania w porównaniu z najbardziej wiarygodnymi standardowymi narzędziami, takimi jak posiewy, badania krwi i zdjęcia rentgenowskie. Zasoby te nie są dostępne automatycznie w żadnym innym ośrodku o tak niezawodnych, niekomercyjnych i bezstronnych właściwościach.

dnr 2015-429-32