Экспресс-тест для выявления очага инфекции у постнейрохирургических больных.

Фактор роста гепатоцитов (HGF) является локальным белком острой фазы с регенеративными свойствами, который становится биологически неактивным при хроническом воспалении и теряет аффинность связывания с гликозаминогликаном во внеклеточном матриксе. HGF экскретируется в желудочно-кишечный тракт и не обнаруживается в нормальной моче. Нозокомиальный менингит может развиться, когда операции на головном мозге осложняются инфекцией. Из-за основных процессов поражения ЦНС и устройств ЦНС in situ основные возбудители нозокомиального бактериального менингита отличаются от возбудителей внебольничного менингита. Например, при внутрибольничных инфекциях преобладают медленно растущие условно-патогенные микроорганизмы. На профиль лейкоцитов ЦСЖ влияет внутримозговое кровоизлияние, а лактат ЦСЖ может быть повышен из-за ишемии. Более того, измененное сознание может затруднить постановку диагноза у пациентов на ИВЛ, у которых после нейрохирургических операций развилась лихорадка. Другими словами, часто бывает трудно определить, заселился ли поврежденный мозг бактериальной флорой из окружающей среды.

Из-за проблем с постановкой диагноза и отсутствия золотых стандартов врачи заинтересованы в лечении подозрений на инфекции при серьезных заболеваниях антибиотиками широкого спектра действия. Новые проблемы бактерий с множественной резистентностью, высокая стоимость и осложнения, связанные с новыми антибиотиками, требуют диагностических тестов, которые могут минимизировать потребление антибиотиков.

В настоящее время диагностика бактериального менингита по-прежнему основывается на стандартных методах прямой микроскопии, дифференциальных анализов лейкоцитов, лактата и белка, культурах крови и ЦСЖ. Однако постнейрохирургические инфекции трудно отличить от последствий нейрохирургических вмешательств. Кроме того, из-за профилактического лечения у большой группы пациентов посев отрицательный, а наличие кожной флоры, такой как коагулазоотрицательный стафилококк или Propionbacterium acnes, может указывать либо на инфекцию, либо на контаминацию. Выживание при этом опасном для жизни состоянии зависит от быстрой диагностики и своевременной эмпирической антибактериальной терапии, предназначенной для подавления вероятных возбудителей.

Где находится очаг инфекции? Это бактериальный (септический) менингит? Показано ли назначение антибиотиков широкого спектра действия? Предыстория проекта: Инвазия бактерий в центральную нервную систему (ЦНС) сопровождается быстро развивающимся воспалительным процессом, поражающим паутинное пространство, мягкую мозговую оболочку и спинномозговую жидкость (ЦСЖ). Это состояние приводит к клиническим симптомам головной боли, лихорадки и менингизма. Воспалительная реакция обусловлена ​​высвобождением различных провоспалительных цитокинов из менингеальных клеток в субарахноидальное пространство. В результате нейтрофилы перемещаются в субарахноидальное пространство и вызывают плеоцитоз в ЦСЖ. Последствия включают нарушение гематоэнцефалического барьера, отек головного мозга, снижение мозгового кровотока, очаговые участки гипоперфузии, тромбоз сосудов, ишемию, усиленный метаболизм глюкозы через анаэробный гликолитический путь и повышенное накопление лактата в головном мозге и ЦСЖ. 1]. Выживание при этом опасном для жизни состоянии зависит от быстрой диагностики и своевременной эмпирической антибактериальной терапии, предназначенной для подавления вероятных возбудителей.

Другие причины фебрильного менингита включают острый вирусный менингит и непиогенный менингит, клиническая картина которых обычно бывает подострой или хронической. Диагностические процедуры включают люмбальную пункцию для анализа ЦСЖ на клетки и бактерии, микробиологические культуры крови и ЦСЖ, серологические тесты, включающие ПЦР и обнаружение антигена, и рентгенографические методы [2]. При внебольничном менингите сочетание отличительных значений анализа ЦСЖ может дифференцировать острый бактериальный менингит от других неамбулаторных причин с достаточно высокой чувствительностью [3].

Нозокомиальный менингит может развиться, когда операции на головном мозге осложняются инфекцией [2]. Из-за основных процессов поражения ЦНС и устройств ЦНС in situ основные возбудители нозокомиального бактериального менингита отличаются от возбудителей внебольничного менингита. На профиль лейкоцитов ЦСЖ влияет внутримозговое кровоизлияние, а лактат ЦСЖ может быть повышен из-за ишемии. Более того, измененное сознание может затруднить постановку диагноза у пациентов на ИВЛ, у которых после нейрохирургических операций развилась лихорадка.

Фактор роста гепатоцитов (HGF) продуцируется мезенхимальными клетками при повреждении органа. Он вырабатывается в виде одноцепочечного белка-предшественника и активируется в месте повреждения путем протеолизного расщепления, что приводит к образованию двухцепочечной активной формы HGF [4]. Активный HGF стимулирует клеточное деление [4] и подвижность клеток, а также способствует нормальной морфогенной структуре [5] в эпителиальных клетках, прилегающих к поврежденным участкам. Таким образом, HGF индуцирует регенерацию и репарацию поврежденной ткани [6]. Высокие уровни системного HGF были обнаружены при травмах, вызванных инфекцией [7]. При бактериальном менингите, пневмонии и остром бактериальном гастроэнтерите происходит локальная продукция HGF в месте инфекции [7-9]. HGF, продуцируемый локально при бактериальной инфекции, является биологически активным [10]. Применение биологически активного HGF способствовало заживлению хронических язв голени в пилотном исследовании [11]. Эффективная антибактериальная терапия снижает системный уровень HGF во время инфекции [12-13]. HGF можно рассматривать как локальный белок острой фазы с лечебными свойствами [14].

Качество связывания эндогенного HGF с рецепторами можно оценить с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) — оптической методики, подходящей для клинических исследований, позволяющей определить сродство белка к нескольким лигандам [15]. Основанная на SPR оценка аффинности связывания HGF с его рецепторами, c-Met и гепарансульфатпротеогликаном (HSPG), может быстро и чувствительно различать варианты HGF с различной биологической активностью [16-17].

Ранее мы изучали концентрацию HGF в ЦСЖ у больных внебольничным менингитом [7]. Нами также показано, что наличие биологически активного HGF в месте повреждения свидетельствует об остром локальном воспалении [18]. В ходе недавнего исследования мы оценили, могут ли концентрации HGF и аффинность связывания HGF с его рецепторами служить маркерами для различения менингита, связанного с нейрохирургией, и других причин инфекции. Мы определили концентрацию и аффинность связывания HGF у пациентов либо с внебольничным менингитом, либо с менингитом, связанным с нейрохирургией, и сравнили результаты либо с пациентами с болезнью Альцгеймера, либо с контрольной группой с нормальной спинномозговой жидкостью. Мы показали, что определение HGF в спинномозговой жидкости можно использовать в качестве индикатора, дополняющего клиническое состояние и рутинные лабораторные данные, для диагностики бактериальной инвазии в спинномозговую жидкость на ранней стадии заболевания [18].

Проблема:

История болезни: 76-летняя женщина с высоким кровяным давлением была найдена соседями в бессознательном состоянии в своем саду 28 октября 2009 года. КТ выявила субарахноидальное кровоизлияние, а нейроангиография выявила 3 ​​аневризмы. Поступила в отделение нейрохирургии и прооперирована 29 октября с дренированием желудочков и эндоваскулярной окклюзией аневризм. После операции она была экстубирована, однако страдала от паралича левой руки и ноги и усталости. С 30 октября у нее субфебрильная температура, незначительное повышение СРБ и прокальцитонина. В спинномозговой жидкости 170 000 эритроцитов и 630 лейкоцитов, лактат 5,8. Рентгенограмма грудной клетки показала подозрение на инфильтрат. Культуры крови и спинномозговой жидкости были сохранены. Посевы, взятые от 5 ноября, выявили значительный рост Enterobacter cloacae и Staphylococcus aurous в моче и рост Staphylococcus aurous в носоглотке. Она не получала антибактериальную терапию, и параметры спонтанно уменьшались, но сохранялась субфебрильная температура. Циркуляция ликвора увеличилась до 23000 эритроцитов и 106 лейкоцитов (11 ноября), лактат ликвора был 4,5 (по люмбальному дренажу). Хотя СРБ был в пределах нормы, она получала меропенен 2 г x 3 при подозрении на бактериальный менингит. Впервые 19 ноября посев СМЖ, взятый 11 ноября, выявил рост Propionibacterium acnes. Антибиотический режим продолжался до 23 ноября. Она страдала от дезориентации, усталости и гидроцефалии. 23 ноября ей сделали шунтирующую операцию. Она умерла 2 декабря 2009 года. Уже 2 ноября в анализе ЦСЖ была обнаружена высокая концентрация HGF и повышенная аффинность связывания с HSPG.

Из-за проблем с постановкой диагноза и отсутствия золотых стандартов врачи мотивированы лечить подозрение на инфекцию индивидуально, поскольку не существует диагностического метода, позволяющего вовремя определить очаг инфекции. ПЦР для бактериальной панели и обнаружения вируса в спинномозговой жидкости является чувствительным методом. Однако он также может обнаруживать колонизированные бактерии. Наличие бактерий — это не то же самое, что инфекция. Поэтому в случаях бактериального менингита, особенно после операции на головном мозге, и инородных тел, вставленных в мозг, мы не можем полностью полагаться на положительные или отрицательные культуры. Дополнительный метод (для стандартных методов, доступных в лаборатории) с высокой отрицательной прогностической ценностью повышает специфичность тестов и значительно снижает затраты, время и осложнения, такие как внутрибольничные инфекции (ИСБ).

Метод обратной метахроматии:

N-конец HGF (петля шпильки) был идентифицирован как сайт связывания как c-Met, так и HSPG. Существует высокая корреляция между связыванием HGF с HSPG и с сульфатом декстрана в системе SPR (рис. 1). Метохромазия — характерное изменение окраски некоторых анилиновых красителей при связывании с хромотропными веществами [19]. Это явление широко используется при изучении срезов тканей. Метиленовый синий (О-толуидин) считается превосходным метахроматическим красителем. При связывании с высокомолекулярными полисахаридами, такими как сульфат декстрана, цвет раствора индикатора меняется с синего на красный [19].

Комбинации сульфата декстрана и О-толуидина в различных пропорциях дают растворы пурпурно-красного цвета различной интенсивности. Индивидуальные фильтровальные бумаги с покрытием представляют собой поверхности, которые помещаются на полоски. При контакте с биологическими растворами образец HGF конкурентно заменяет О-толуидин для связывания с сульфатом декстрана, и цвет поверхности возвращается к синему (рис. 2). Эта платформа обнаруживает присутствие HSPG-связывающих белков, таких как HGF, в жидкостях организма, включая отхаркивающие средства, мочу, выделения из язв, спинномозговую жидкость и суставной выпот во время инфекции. Большое количество белка или высокий уровень pH не вызывают неспецифических реакций с этим устройством.

План исследования:

Руководитель исследования: Амир Рамезани

Процедура:

Образцы спинномозговой жидкости, мочи и мокроты (n=500) собирают у пациентов (в возрасте 1–99 лет), перенесших операцию по поводу опухоли головного мозга, внутримозговое кровоизлияние, дисфункцию шунта или перелом черепа. Образцы хранят в замороженном виде при температуре -20°C до тех пор, пока не будут проведены анализы. Критериев исключения нет.

Контролирует болезнь Альцгеймера (n=20)

• Образцы спинномозговой жидкости были собраны и хранились в замороженном виде у пациентов (N = 20), у которых была диагностирована болезнь Альцгеймера в клинике памяти Университетской больницы Сконе в Мальмё. Пересмотренные критерии DSM-III и NINDS-ADRDA использовались для диагностики деменции Альцгеймера (эта исследовательская группа была включена в предыдущее исследование).
• Нормальная спинномозговая жидкость
• Эта группа состоит из пациентов, перенесших люмбальную пункцию для исключения менингита, и у них был нормальный ЦСЖ.
• Анализ сродства связывания лиганда с поверхностным плазмонным резонансом
• Биологическую активность HGF анализируют с помощью SPR. Мы измеряли аффинность связывания с HSPG (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и с рекомбинантной химерой c-Met (R&D Systems), как описано ранее.
• Измерения концентраций HGF в образцах Для определения концентраций HGF в спинномозговой жидкости использовали набор для специфического иммуноферментного анализа (ELISA) (иммуноанализ Quantikine Human HGF, минимальный предел обнаружения: 0,04 нг/мл; R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США). мокроты и мочи в соответствии с инструкциями производителя. Все измерения были выполнены с помощью устройства для считывания ELISA (Expert96; AsysHitech GmbH, Eugendorf, Austria) при 450 нм, которое было откалибровано с помощью эталонных образцов рекомбинантного HGF человека и стандартов, предоставленных в наборе.
• Обратная метахромазия Тест с полосками проводится на всех образцах.
• Обычные лабораторные оценки
• ЦСЖ анализируют для определения значений параметров в отделениях клинической химии университетских больниц в Линчепинге. Все культуры, ПЦР-анализы, анализы на обнаружение антигенов и серологические оценки выполняются в отделении микробиологии университетской больницы, Линчепинг, Швеция.
• CSF-клетки: выполнено с помощью ручной фазово-контрастной микроскопии (Zeiss) с использованием камеры Джессена для подсчета количества эритроцитов и лейкоцитов (полиморфноядерных нейтрофилов и моноцитов).
• Лактат спинномозговой жидкости: выполнено с использованием настольного анализатора газов крови ABL 800 (Radiometer Medical ApS, Дания).
• Выявление антигена: Антиген (Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides группа A, группа B/Escherichia coli K1, группа C и группа Y/135, Streptococcus agalactiae) выявляется методом латекс-агглютинации Pastorex Meningitis™ (Bio-Rad, Франция) .
• Культура спинномозговой жидкости: проводится в аэробных и анаэробных колбах, а также в чашках с гематином.
• ПЦР для обнаружения вируса: вирусы герпеса типа 1 и 2 (HSV1, HSV 2) и ДНК HZV были обнаружены с помощью ПЦР. Энтеровирус человека (HEV) анализировали с помощью автоматизированного прибора (Cepheid GeneXpert).
• статистический анализ
• Поскольку концентрации HGF и данные об аффинности связывания обычно не распределяются, для анализа подходят непараметрические тесты, критерий Крускала-Уоллиса, за которым следует U-критерий Манна-Уитни или критерий согласованных пар Уилкоксона. Анализ производительности теста должен выполняться вручную.

Клиническая оценка платформы в геле, содержащем сульфат декстрана. Используя метод обратной метахроматики, мы изучили в общей сложности 656 образцов фекалий. Чувствительность, специфичность, положительное прогностическое значение и отрицательное прогностическое значение, а также точность были рассчитаны в следующих группах. : верифицированный инфекционный гастроэнтерит (n=207) и другие причины диареи, включая ВЗК (n=268). Тест мог распознать острый инфекционный гастроэнтерит с чувствительностью 96,6% и специфичностью 92,4%, положительной прогностической ценностью 90,9% и отрицательной прогностической ценностью 97,2%. Точность теста составила 94,3%. Достоверной корреляции между результатами теста и кальпротектином фекалий не обнаружено (R2=0,056). Достоверной корреляции между результатами индексного теста и наличием крови в фекалиях не наблюдалось (R2=0,08) [20].

Клиническая оценка HGF как маркера, позволяющего отличить септический менингит от других причин плеоцитоза [18]. Внебольничный септический менингит показал значительно более высокую концентрацию HGF (p = 0,0133), а также аффинность связывания HGF с рецепторами c-Met и HSPG. (p=0,0007 и p=0,0009 соответственно) по сравнению с нозокомиальным менингитом. Образцы спинномозговой жидкости от пациентов с септическим менингитом (включая как внебольничный, так и внутрибольничный) были значительно выше в концентрациях HGF (p = 0,0014), Связывание HGF с HSPG (p<0,0001) и связывание HGF с c-Met (p<0,0001) по сравнению с образцами пациентов с асептическим (вирусным и подострым) менингитом. Образцы ЦСЖ от пациентов с септическим менингитом были выше по сравнению с образцами из контрольной группы (пациенты с нормальным ЦСЖ) и от пациентов с болезнью Альцгеймера по концентрации HGF (p<0,0001, p=0,0010 соответственно), связывание HGF с HSPG (p<0,0001 и p=0,9 соответственно) и связывание HGF с c-Met (оба p<0,0001).

По сравнению с образцами от пациентов, перенесших нейрохирургические вмешательства и страдающих другими инфекционными заболеваниями, образцы спинномозговой жидкости от пациентов с нозокомиальным менингитом имели значительно более высокие концентрации HGF (p<0,0001) и аффинность связывания HGF с c-Met (p<0,0001) и HSPG (p= 0,043) рецепторы (рис. 3-4).

Подписи к рисункам Рис. 1. Последовательность части α-цепи HGF. Увеличенные кодоны кодируют аминокислоты, важные для связывания с HSPG и рецептором c-Met.

Рис. 2. Теоретическая поддержка второго подхода к устройству для обнаружения присутствия HGF в жидкостях организма во время инфекции. (1) Полимерная цепь глюкозаминогликана (ГАГ) с отрицательным зарядом. (2) Положительные молекулы ТВО прикрепляются к полимерной цепи, затем концентрируются и образуют стопки. Цвет меняется с синего на красный. (3) Добавляется образец с HGF, который связывается с GAG. (4) Стопки молекул ТВО разрушаются и превращаются в свободно растворенные молекулы ТВО. Цвет меняется с красного на синий.

Рисунок 3: Блок-схема отбора образцов спинномозговой жидкости от пациентов и контрольных групп. Дополнительные образцы – это образцы, взятые во время пребывания в стационаре у пациентов с нозокомиальным менингитом.

Рисунок 4: Свойства HGF, полученного из различных образцов CSF, были проанализированы с использованием методов поверхностного плазмона и ELISA. (A) Связывание с рецепторами c-Met; (B) связывание с рецепторами HSPG; (C) Концентрации HGF (медиана). *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001, ****р<0,0001.

Быстрая эволюция и распространение устойчивых к противомикробным препаратам бактерий при недостаточной разработке новых активных препаратов серьезно влияет на будущую противоинфекционную терапию бактериальных инфекций, особенно вызванных грамотрицательными палочками. По оценкам экспертов в этой области, к следующему десятилетию мир станет свидетелем широкого распространения неизлечимых (или почти неизлечимых) инфекций как внутри больниц, так и за их пределами. Чтобы избежать или, по крайней мере, попытаться отсрочить этот кризис, многие исследователи посвятили свои усилия выяснению факторов, способствующих возникновению и глобальному распространению устойчивых к противомикробным препаратам бактерий. Эффективная стратегия по ограничению появления множественных резистентных штаммов может включать направление антибактериальной терапии путем выявления случаев, когда следует или не следует проводить лечение антибиотиками, избегая назначения антибиотиков широкого спектра действия и продвигая более специфические методы лечения.

Что необходимо, так это простой, точный, экономичный и выполнимый тест, который отвечает на важные вопросы.

Для оценки клинической значимости и эффективности такого теста нет лучшей среды, чем шведское здравоохранение, которое обеспечивает актуальную и современную оценку заболеваний и доказательную терапию почти для всех пациентов. Такая среда дает возможность выполнить включение пациента и оценку исследуемого теста по сравнению с наиболее надежными стандартными инструментами, такими как посев, анализы крови и рентген. Эти ресурсы не доступны автоматически ни в одном другом центре с такими надежными, некоммерческими и беспристрастными свойствами.

днр 2015-429-32