Onderzoek naar de correlatie tussen het testen van de gevoeligheid voor geneesmiddelen op organoïden en de nauwkeurige behandeling van maag-darmtumoren

Deze studie is een eenarmige, multicentrische, open-label, prospectieve klinische studie.

1. Steekproefomvang Dit onderzoek is een klinisch verkennend onderzoek en er wordt geen schatting gemaakt van de steekproefomvang. Er wordt verwacht dat het 68 patiënten zal omvatten met tumoren van het spijsverteringskanaal, waaronder 16 gevallen van slokdarmkanker, maagkanker en colorectale kanker, en 20 gevallen van gastro-intestinale stromale tumoren.

1.1Participatiecentrum Landelijk zijn ongeveer 10-15 onderzoekscentra betrokken. 2.Caseselectie 2.1Selectiecriteria

Om geselecteerd te worden, moet aan alle volgende voorwaarden worden voldaan:

1. De leeftijd varieert van 18 tot 75 jaar, ongeacht geslacht;
2. Patiënten met slokdarmkanker, maagkanker, colorectale kanker en gastro-intestinale stromale tumoren bevestigd door histopathologie/cytologie;

3. De toestand van de proefpersoon voldoet aan een van de volgende voorwaarden:

   Slokdarmkanker: klinische stadiëring is stadium II (cT1-2N1-3M0/cT3-4NOMO) of stadium III (cT3-4aN1-3MO); Maagkanker: Klinische stadiëring is stadium II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) of stadium III (cT3-4aN1-3MO); Colorectale kanker: klinische stadiëring is stadium II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) of stadium III (cT3-4aN1-3MO) Gastro-intestinale stromale tumoren: Primaire stromale tumoren met lokaal geavanceerde risicoclassificatie (spontane ruptuur van de tumor; tumordiameter >10cm; mitotisch beeld>10/5mm) ²; Tumordiameter>5cm en mitotische telling>5/5mm²; 5 cm ≤ tumordiameter> 2 cm en mitotisch beeld> 5/5 mm ² Niet maag-primair; 10 cm ≤ tumordiameter> 5 cm en mitotisch beeld ≤ 5/5 mm² (niet-primaire maag-stromale tumor) of terugkerende metastatische/niet-reseceerbare gastro-intestinale stromale tumor.

4. De patiënt of wettelijke vertegenwoordiger neemt vrijwillig deel aan dit onderzoek en ondertekent 2.2 Uitsluitingscriteria

Eén van de volgende situaties kan niet in deze proef worden meegenomen:

1. Lijdt aan systemische ontstekingsziekten en/of stollingsstoornissen;
2. Er zijn ernstige lever- en nierziekten, hart- en vaatziekten, luchtwegaandoeningen of ongecontroleerde diabetes;
3. Lijdend aan andere kwaadaardige tumoren van het systeem;
4. Patiënten met een psychische aandoening die niet kunnen meewerken aan het voltooien van het onderzoek;
5. Bekende allergieën voor mogelijke chemotherapiemedicijnen of chirurgische contra-indicaties;
6. Patiënten van wie de toestand niet ongedaan kan worden gemaakt of die op sterven liggen;
7. Niet in staat om voldoende tumorweefsel te verkrijgen via biopsiechirurgie voor organoïdekweek en histologische analyse;
8. Zwangerschap of borstvoeding, of van plan om binnen de komende zes maanden een vruchtbaarheidsplan te maken;
9. Slechte gezondheidsstatus, KPS-score <70 punten, of ECOG-score ≥ 3 punten;
10. Het ontvangen van een andere behandeling met geneesmiddelen tegen kanker, biologische therapie, bestralingstherapie of immunosuppressieve therapie binnen 4 weken; 3. Onderzoeksmethode 3.1 Verzameling van tumororgaanmonsters Vers weefsel, geschikte en voldoende monstergrootte, probeer normaal weefsel volledig te verwijderen om interferentie te verminderen.

Endoscopische biopsie: neem met een pincet 3 of meer stukjes, met een totale hoeveelheid van ≥ 0,5 g, en verzamel rijke gebieden met kankercellen; Punctiebiopsie: met een totale lengte van ≥ 3 cm (elk stuk is 1 cm of meer, in totaal 3 stuks), verzamel rijke gebieden met kankercellen; Ascitespunctie/drainage: Totaal volume boven 250 ml, om onzuiverheden te voorkomen en de aanwezigheid van tumorcellen te garanderen.

3.2 Transport in de koude keten De verzamelde tumormonsters moeten 24 uur op ijs bij 2-8 ℃ worden bewaard en naar het laboratorium worden afgeleverd.

3.3 Testen van geneesmiddelgevoeligheid in orgaanmodellen

1. Organoïdecultuur I Het verkrijgen van celsuspensie

   ① Tumorcelsuspensie: Na het verwijderen van necrotisch weefsel, vetweefsel en vezelig weefsel uit het monster, wordt het effectieve monster in tumorweefselfragmenten met een diameter van 1 mm gesneden, en vervolgens worden de weefselfragmenten verteerd met behulp van weefseldissociatie-oplossing. Gebruik het steriele filter van 70-100 μM om het verteerde weefsel te filteren en het filtraat wordt 5 minuten gecentrifugeerd voordat het supernatant wordt weggegooid. Gebruik rode bloedcellysase om de rode bloedcellen in de suspensie te lyseren, centrifugeer en suspendeer het neerslag met behulp van PBS.

   • Kwaadaardige vloeibare celsuspensie: met behulp van een steriel filter van 70-100 μM wordt kwaadaardige vloeistof gefilterd, vaste suspensie verwijderd, gecentrifugeerd en het neerslag gesuspendeerd met behulp van PBS.

   II Verificatie van de levensvatbaarheid van de cellen: Gebruik de trypaanblauwkleuringsmethode om de levensvatbaarheid van de cellen te observeren en ervoor te zorgen dat het aandeel levende cellen groter is dan 80%.

2. Aanbrengen van organoïden Verdeel de gemengde matrixgel van levende tumorcellen gelijkmatig over de vooraf voorbereide kweekplaat, voeg een geschikt celkweekmedium toe en plaats het vervolgens in een incubator van 37 ℃, 5% CO₂ voor statische kweek.
3. Verificatie van de organogenesesnelheid Pathologische, genetische tests en immunohistochemische validatie worden uitgevoerd op monsters van met succes gekweekte organoïden om de succesvolle constructie van tumororganoïden te bevestigen. Als de validatie betrekking heeft op normaal weefsel, faalt het monster en wordt er tijdig feedback gegeven aan de klinische bemonsteringsarts.
4. Gevoeligheidsverificatie van organoïde medicijnen Na een succesvolle kweek werden de organoïden verdeeld in de volgende vier groepen: nulgroep (exclusief organoïden, die alleen celkweekmedium bevatten); Negatieve controle (organoïde+medicijnoplosmiddel); Positieve controle (organoïde+astrosporine); Testgroep voor geneesmiddelgevoeligheid (organoïde + testgeneesmiddel); Elke groep heeft drie putten en het geselecteerde medicijn voor het testen van de medicijngevoeligheid is gebaseerd op de aanbevelingen van de onderzoekers en de diagnose- en behandelingsrichtlijnen van de Chinese Society of Clinical Oncology. De klinische dosis wordt als basis gebruikt en er worden drie concentraties hoog, gemiddeld en laag ingesteld met een drievoudige gradiënt.
5. Testen van de levensvatbaarheid van de cellen De levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten met behulp van ATP-biofluorescentie-detectietechnologie voor geneesmiddelgevoeligheid (ATP-TCA). Het complex van fluorescerend pigment en fluorescerend enzym kan een chemische reactie ondergaan met de deelname van ATP om fluorescentie te produceren. De uitgezonden fluorescentie-intensiteit weerspiegelt het ATP-gehalte, dat op zijn beurt het aantal levende cellen weerspiegelt. De ATP-biofluorescentietechnologie voor detectie van geneesmiddelgevoeligheid maakt gebruik van het intracellulaire ATP-gehalte als eindpunt voor het meten van de celactiviteit, waarmee de verschillen tussen verschillende geneesmiddelen en hetzelfde geneesmiddel bij verschillende concentraties kunnen worden gemeten.
6. Verwerving van indicatoren voor geneesmiddelgevoeligheid. Orgaanachtige groeiremming: de remmingsgraad (IR) van verschillende geneesmiddelconcentraties op organoïden.

Beoordeling van de geneesmiddelgevoeligheid: De groeiremming van het geneesmiddel op organoïden bij klinische werkingsconcentratie wordt gebruikt als een gevoeligheidsindicator voor tumororganoïden voor geneesmiddelen. Een remmingsgraad van minder dan 20 geeft aan dat organoïden resistent zijn tegen het medicijn, een remmingsgraad van 20-40 duidt op milde gevoeligheid, een remmingsgraad van 40-70 duidt op matige gevoeligheid, en een remmingsgraad groter dan 70 geeft aan dat organoïden zeer gevoelig zijn. aan het medicijn.

De bovenstaande technische ondersteuning wordt geleverd door een professioneel technisch platform van derden: Shanghai Biomass Drug Evaluation/Luzhou Health Product Testing Center; De tijd voor het verstrekken van resultaten over de gevoeligheid voor geneesmiddelen bedraagt ​​ongeveer 2 weken. Het testen van de geneesmiddelgevoeligheid van gastro-intestinale stromale tumoren zal worden uitgevoerd op basis van de onderzoeksresultaten van de 3D-kweekmethode en overeengekomen met de hoofdeenheid van het project.

3.4 Medicatieplannen ontwikkelen Construeer een tumor-organoïdemodel op basis van biopsiespecimens en ontwikkel een behandelplan op basis van de resultaten van de organoïde medicijngevoeligheid, gecombineerd met diagnostische en behandelrichtlijnen/consensus van deskundigen, en klinische ervaring van onderzoekers.

Het algemene behandelplan voor alle proefpersonen wordt opgesteld door de onderzoekers van het subcentrum op basis van hun aandoening.

4. Onderzoeksprocedures Dit onderzoek is verdeeld in vier delen: screeningperiode, planningsperiode, observatieperiode voor de behandeling en follow-upperiode voor progressie.

5. Evaluatie van de werkzaamheid Evalueer en vergelijk na de behandeling tumoren van dezelfde categorie. 5.1 Indicatoren voor de evaluatie van de werkzaamheid

• Vergelijk de verschillen tussen de resultaten van de gevoeligheid voor organoïde geneesmiddelen en de aanbevolen behandelplannen op basis van richtlijnen/consensus; ② Veranderingen in de doellaesies vergeleken met de uitgangswaarde na 3 behandelingscycli: CT van de borstkas en de buik of MRI of PET-CT;

  • Herhalingspercentage; Gebaseerd op follow-upinformatie van patiënten; ④ Mediane progressievrije overlevingstijd en mediane overlevingstijd van patiënten: gecombineerd met de cyclusinformatie van elke tumor tijdens de follow-up van de patiënt.

5.2 Criteria voor het bepalen van de werkzaamheid

De werkzaamheid wordt geëvalueerd volgens de criteria van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor solide tumoren:

• Volledige respons (CR): Alle doellaesies verdwijnen en de korte-aswaarden van alle pathologische lymfeklieren zijn minder dan 10 mm;

  • Gedeeltelijke respons (PR): verwijst naar de som van de kritische straal, met een minimale reductie van 30% in de som van alle doellaesiestralen; ③ Stabiele ziekte (SD): verwijst naar de minimumwaarde van het totaal van de waargenomen doellaesies, die niet voldoet aan de progressiecriteria en ook niet voldoet aan de remissiecriteria; ④ Progressieve ziekte (PD): De minimumwaarde van het totale aantal waargenomen doellaesies, de minimale toename van 20% in de totale straal van alle doellaesies, en de absolute waarde van de totale toename van de straal van de doellaesies>5 mm. Berekening: Effectief percentage na behandeling=(CR+PR)/totaal aantal gevallen x 100,0%; Het objectieve responspercentage (OR) omvat CR+PR bevestigd met een tussenpoos van ten minste vier weken; Het ziektecontrolepercentage (DCR) omvat bevestigde tumorremissie (CR+PR) en patiënten bij wie SD is geregistreerd na ten minste vier weken drugsgebruik, d.w.z. CR+PR+SD.

    • Terugkeer van de tumor: Tijdens beeldvormend onderzoek na de behandeling werd vastgesteld dat de tumor zes maanden na gedeeltelijke remissie opnieuw uitbreidde, en dat nieuwe tumoren terugkeerden in andere delen of afgelegen gebieden van de primaire laesie; Na zes maanden volledige remissie werd via beeldvormend onderzoek een tumorrecidief (inclusief lokaal recidief, regionaal recidief en recidief op afstand) ontdekt.