Badania nad korelacją między badaniem wrażliwości organoidów na leki a precyzyjnym leczeniem nowotworów przewodu pokarmowego

Niniejsze badanie jest jednoramiennym, wieloośrodkowym, otwartym, prospektywnym badaniem klinicznym.

1. Wielkość próby Niniejsze badanie ma charakter kliniczny i nie szacuje wielkości próby. Oczekuje się, że badanie obejmie 68 pacjentów z nowotworami przewodu pokarmowego, w tym po 16 przypadków raka przełyku, żołądka i jelita grubego oraz 20 przypadków nowotworów podścieliskowych przewodu pokarmowego.

1.1 Centrum uczestnictwa W całym kraju zaangażowanych jest około 10-15 ośrodków badawczych. 2. Wybór przypadku 2.1 Kryteria wyboru

Aby zostać wybranym, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe warunki:

1. Przedział wiekowy od 18 do 75 lat, niezależnie od płci;
2. Pacjenci z rakiem przełyku, rakiem żołądka, rakiem jelita grubego i guzami podścieliskowymi przewodu pokarmowego potwierdzonymi badaniem histopatologicznym/cytologicznym;

3. Stan podmiotu spełnia jeden z następujących warunków:

   Rak przełyku: stopień zaawansowania klinicznego to II (cT1-2N1-3M0/cT3-4NOMO) lub III (cT3-4aN1-3MO); Rak żołądka: Stopień zaawansowania klinicznego to II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) lub III (cT3-4aN1-3MO); Rak jelita grubego: stopień zaawansowania klinicznego to II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) lub stopień III (cT3-4aN1-3MO) Guzy podścieliskowe przewodu pokarmowego: Pierwotne nowotwory podścieliskowe z lokalnie zaawansowaną klasyfikacją ryzyka (samoistne pęknięcie guza; średnica guza >10cm; obraz mitotyczny >10/5mm) ²; średnica guza >5cm i liczba mitotyczna >5/5mm²; 5cm ≤ średnica guza >2cm i obraz mitotyczny >5/5mm ² Pierwotny inny niż żołądkowy; 10cm ≤ średnica guza > 5cm i obraz mitotyczny ≤ 5/5mm ² (niepierwotny guz podścieliskowy żołądka) lub nawracający przerzutowy/nieoperacyjny guz podścieliskowy przewodu pokarmowego.

4. Pacjent lub przedstawiciel prawny dobrowolnie uczestniczy w tym badaniu i podpisuje 2.2 Kryteria wykluczenia

Jedna z następujących sytuacji nie może zostać uwzględniona w tym badaniu:

1. Cierpi na ogólnoustrojowe choroby zapalne i/lub zaburzenia krzepnięcia;
2. Występują poważne choroby wątroby i nerek, choroby układu krążenia, choroby układu oddechowego czy nieleczona cukrzyca;
3. Cierpi na inne nowotwory złośliwe układu;
4. Pacjenci z chorobami psychicznymi, którzy nie są w stanie współpracować przy ukończeniu badania;
5. Znane alergie na potencjalne leki stosowane w chemioterapii lub przeciwwskazania chirurgiczne;
6. Pacjenci, których stanu nie można odwrócić lub są w stanie umierającym;
7. Nie można uzyskać wystarczającej ilości tkanki nowotworowej poprzez biopsję do hodowli organoidów i analizy histologicznej;
8. Ciąża lub laktacja lub planowanie planu płodności w ciągu najbliższych 6 miesięcy;
9. Zły stan zdrowia, wynik KPS <70 punktów lub wynik ECOG ≥ 3 punkty;
10. poddanie się w ciągu 4 tygodni jakimkolwiek innym lekom przeciwnowotworowym, terapii biologicznej, radioterapii lub terapii immunosupresyjnej; 3.Metoda badawcza 3.1Pobieranie próbek narządów nowotworowych Świeża tkanka, odpowiednia i wystarczająca wielkość próbki, należy spróbować całkowicie usunąć normalną tkankę, aby zmniejszyć zakłócenia.

Biopsja endoskopowa: Pobrać kleszczami 3 lub więcej kawałków o łącznej masie ≥ 0,5 g i pobrać bogate obszary komórek nowotworowych; Biopsja punkcyjna: o długości całkowitej ≥ 3cm (każdy kawałek ma 1cm lub więcej, łącznie 3 sztuki), pobierz bogate obszary komórek nowotworowych; Nakłucie/drenaż wodobrzusza: Całkowita objętość powyżej 250 ml, aby uniknąć zanieczyszczeń i zapewnić obecność komórek nowotworowych.

3.2 Transport w łańcuchu chłodniczym Zebrane próbki nowotworu należy przechowywać w lodzie w temperaturze 2-8 ℃ przez 24 godziny i dostarczyć do laboratorium.

3.3 Modelowe badanie wrażliwości na leki

1. Hodowla organoidów I Otrzymywanie zawiesiny komórek

   ① Zawiesina komórek nowotworowych: Po usunięciu z próbki tkanki martwiczej, tkanki tłuszczowej i tkanki włóknistej, skuteczną próbkę pocina się na fragmenty tkanki nowotworowej o średnicy 1 mm, a następnie fragmenty tkanki trawi się roztworem do dysocjacji tkanek. Użyj sterylnego filtra 70-100 μM, który filtruje strawioną tkankę, a filtrat wiruje się przez 5 minut przed odrzuceniem supernatantu. Do lizy czerwonych krwinek w zawiesinie użyć lizazy krwinek czerwonych, odwirować i zawiesić osad w PBS.

   • Zawiesina komórek płynu złośliwego: przy użyciu sterylnego filtra 70–100 μM służy do filtrowania płynu złośliwego, usuwania zawiesiny stałej, odwirowywania i zawieszania osadu za pomocą PBS.

   II Weryfikacja żywotności komórek: Aby obserwować żywotność komórek, należy zastosować metodę barwienia błękitem trypanu i upewnić się, że odsetek żywych komórek jest większy niż 80%.

2. Zakładanie organoidów Rozprowadź równomiernie wymieszany żel matrycowy żywych komórek nowotworowych na wcześniej przygotowaną płytkę hodowlaną, dodaj odpowiednią pożywkę do hodowli komórkowej, a następnie umieść ją w inkubatorze o temperaturze 37 ℃ i 5% CO₂ w celu hodowli statycznej.
3. Weryfikacja szybkości organogenezy Testy patologiczne, genetyczne i walidację immunohistochemiczną przeprowadza się na próbkach organoidów, które pomyślnie wyhodowano, w celu potwierdzenia pomyślnej konstrukcji organoidów nowotworowych. Jeżeli walidacja dotyczy normalnej tkanki, próbka kończy się niepowodzeniem, a lekarz pobierający próbki kliniczne otrzymuje w odpowiednim czasie informację zwrotną.
4. Weryfikacja wrażliwości leków organoidowych Po udanej hodowli organoidy podzielono na cztery grupy: grupa zerująca (bez organoidów, zawierająca wyłącznie pożywkę komórkową); Kontrola negatywna (organoid + rozpuszczalnik leku); Kontrola pozytywna (organoid+astrosporyna); Grupa badająca wrażliwość na leki (organoid + lek testowany); Każda grupa ma trzy dołki, a wybrany lek do badania wrażliwości na leki opiera się na zaleceniach badaczy oraz wytycznych dotyczących diagnostyki i leczenia Chińskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej. Jako podstawę przyjmuje się dawkę kliniczną i ustala się trzy stężenia: wysokie, średnie i niskie, z 3-krotnym gradientem.
5. Testowanie żywotności komórek Żywotność komórek mierzono przy użyciu technologii wykrywania wrażliwości na leki za pomocą biofluorescencji ATP (ATP-TCA). Kompleks pigmentu fluorescencyjnego i enzymu fluorescencyjnego może ulegać reakcji chemicznej z udziałem ATP w celu wytworzenia fluorescencji. Intensywność emitowanej fluorescencji odzwierciedla zawartość ATP, która z kolei odzwierciedla liczbę żywych komórek. Technologia wykrywania wrażliwości leku na biofluorescencję ATP wykorzystuje wewnątrzkomórkową zawartość ATP jako punkt końcowy pomiaru aktywności komórek, który może mierzyć różnice między różnymi lekami i tym samym lekiem w różnych stężeniach.
6. Akwizycja wskaźników wrażliwości na leki. Stopień hamowania wzrostu narządowego: Stopień hamowania (IR) różnych stężeń leku na organoidach.

Ocena wrażliwości na lek: Szybkość hamowania wzrostu organoidów przez lek w stężeniu o działaniu klinicznym wykorzystuje się jako wskaźnik wrażliwości organoidów nowotworowych na leki. Stopień hamowania mniejszy niż 20 wskazuje, że organoidy są oporne na lek, stopień hamowania 20–40 wskazuje na łagodną wrażliwość, stopień hamowania 40–70 wskazuje na umiarkowaną wrażliwość, a stopień hamowania większy niż 70 wskazuje, że organoidy są bardzo wrażliwe do leku.

Powyższe wsparcie techniczne zapewnia zewnętrzna profesjonalna platforma techniczna: Shanghai Biomass Drug Evaluation/Luzhou Health Product Testing Center; Czas na wydanie wyników lekooporności wynosi około 2 tygodnie. Badanie wrażliwości lekowej guzów podścieliskowych przewodu pokarmowego zostanie przeprowadzone w oparciu o wyniki eksploracji metody hodowli 3D i uzgodnione z jednostką główną projektu.

3.4 Opracowywanie planów leczenia Zbuduj model organoidu nowotworu w oparciu o próbki biopsyjne i opracuj plan leczenia w oparciu o wyniki wrażliwości organoidu na lek, w połączeniu z wytycznymi dotyczącymi diagnostyki i leczenia/konsensusem ekspertów oraz doświadczeniem klinicznym badaczy.

Ogólny plan leczenia wszystkich pacjentów jest formułowany przez badaczy z podośrodka na podstawie ich stanu.

4. Procedury badawcze Badanie to jest podzielone na cztery części: okres przesiewowy, okres planowania, okres obserwacji leczenia i okres obserwacji progresji.

5. Ocena skuteczności Po leczeniu należy ocenić i porównać nowotwory tej samej kategorii. 5.1 Wskaźniki oceny skuteczności

• Porównaj różnice między wynikami wrażliwości organoidów na leki a zalecanymi planami leczenia w oparciu o wytyczne/konsensus; ② Zmiany docelowych zmian w porównaniu do wartości wyjściowych po 3 cyklach leczenia: CT klatki piersiowej i jamy brzusznej lub MRI lub PET-CT;

  • Częstotliwość nawrotów; Na podstawie informacji uzyskanych z obserwacji pacjenta; ④ Mediana czasu przeżycia wolnego od progresji i mediana czasu przeżycia pacjentów: w połączeniu z informacjami o cyklu każdego nowotworu podczas obserwacji pacjenta.

5.2 Kryteria określania skuteczności

Skuteczność ocenia się według kryteriów Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) dla guzów litych:

• Odpowiedź całkowita (CR): znikają wszystkie zmiany docelowe, a wartości wszystkich patologicznych węzłów chłonnych na osi krótkiej są mniejsze niż 10 mm;

  • Częściowa odpowiedź (PR): odnosi się do sumy promienia krytycznego, przy minimalnym zmniejszeniu o 30% sumy wszystkich docelowych promieni zmiany chorobowej; ③ Choroba stabilna (SD): odnosi się do minimalnej wartości całkowitej zaobserwowanych zmian docelowych, która nie spełnia kryteriów progresji, a także nie spełnia kryteriów remisji; ④ Choroba postępująca (PD): Minimalna wartość całkowitego zaobserwowanego obszaru zmian docelowych, minimalny wzrost o 20% całkowitego promienia wszystkich docelowych zmian chorobowych oraz wartość bezwzględna całkowitego wzrostu promienia docelowych zmian chorobowych > 5 mm. Obliczenie: Efektywny wskaźnik po leczeniu = (CR+PR)/całkowita liczba przypadków x 100,0%; Wskaźnik obiektywnych odpowiedzi (OR) obejmuje CR+PR potwierdzone w odstępie co najmniej 4 tygodni; Wskaźnik kontroli choroby (DCR) obejmuje potwierdzoną remisję nowotworu (CR+PR) oraz pacjentów, u których stwierdzono SD po co najmniej 4 tygodniach stosowania leku, tj. CR+PR+SD.

    • Wznowa nowotworu: Podczas badania obrazowego po leczeniu stwierdzono, że guz ponownie powiększył się 6 miesięcy po częściowej remisji, a nowe guzy nawróciły w innych częściach lub odległych obszarach zmiany pierwotnej; Po 6 miesiącach całkowitej remisji w badaniu obrazowym wykryto wznowę nowotworu (w tym wznowę miejscową, wznowę regionalną i wznowę odległą).