Pesquisa sobre a correlação entre testes de sensibilidade a medicamentos organoides e tratamento preciso de tumores gastrointestinais

Este ensaio é um estudo clínico prospectivo de braço único, multicêntrico, aberto.

1. Tamanho da amostra Este estudo é um estudo clínico exploratório e não estima o tamanho da amostra. Espera-se que inclua 68 pacientes com tumores do trato digestivo, incluindo 16 casos de câncer de esôfago, câncer gástrico e câncer colorretal, e 20 casos de tumores estromais gastrointestinais.

1.1Centro de Participação Aproximadamente 10-15 centros de pesquisa estão envolvidos em todo o país. 2.Seleção de caso 2.1Critérios de seleção

Para ser selecionado, todas as seguintes condições devem ser atendidas:

1. Faixa etária de 18 a 75 anos, independente do sexo;
2. Pacientes com câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer colorretal e tumores estromais gastrointestinais confirmados por histopatologia/citologia;

3. A condição do sujeito atende a uma das seguintes condições:

   Câncer de esôfago: o estadiamento clínico é estágio II (cT1-2N1-3M0/cT3-4NOMO) ou estágio III (cT3-4aN1-3MO); Câncer gástrico: O estadiamento clínico é estágio II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) ou estágio III (cT3-4aN1-3MO); Câncer colorretal: estadiamento clínico é estágio II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) ou estágio III (cT3-4aN1-3MO) Tumores estromais gastrointestinais: Tumores estromais primários com classificação de risco localmente avançada (ruptura espontânea do tumor; diâmetro do tumor >10cm; imagem mitótica >10/5mm)²; Diâmetro tumoral>5cm e contagem mitótica>5/5mm²; 5cm ≤ diâmetro tumoral>2cm e imagem mitótica>5/5mm ² Primário não gástrico; 10cm ≤ diâmetro do tumor>5cm e imagem mitótica ≤ 5/5mm² (tumor estromal gástrico não primário) ou tumor estromal gastrointestinal metastático/irressecável recorrente.

4. O paciente ou representante legal participa voluntariamente deste estudo e assina 2.2 Critérios de exclusão

Uma das seguintes situações não pode ser incluída neste ensaio:

1. Sofrer de doenças inflamatórias sistêmicas e/ou distúrbios de coagulação;
2. Existem doenças hepáticas e renais graves, doenças cardiovasculares, doenças respiratórias ou diabetes não controlada;
3. Sofrendo de outros tumores malignos do sistema;
4. Pacientes com doença mental que não conseguem cooperar na conclusão do estudo;
5. Alergias conhecidas a potenciais medicamentos quimioterápicos ou contraindicações cirúrgicas;
6. Pacientes cuja condição não pode ser revertida ou em estado de morte;
7. Incapaz de obter tecido tumoral suficiente através de cirurgia de biópsia para cultura organoide e análise histológica;
8. Gravidez ou lactação, ou planejamento de plano de fertilidade nos próximos 6 meses;
9. Mau estado de saúde, pontuação KPS <70 pontos ou pontuação ECOG ≥ 3 pontos;
10. Receber qualquer outro tratamento medicamentoso anticâncer, terapia biológica, radioterapia ou terapia imunossupressora dentro de 4 semanas; 3.Método de pesquisa 3.1Coleta de amostras de órgãos tumorais Tecido fresco, tamanho de amostra apropriado e suficiente, tente remover completamente o tecido normal para reduzir a interferência.

Biópsia endoscópica: Retirar 3 ou mais peças com pinça, com quantidade total ≥ 0,5g, e coletar áreas ricas em células cancerígenas; Biópsia por punção: com comprimento total ≥ 3cm (cada peça tem 1cm ou mais, total de 3 peças), coletar áreas ricas em células cancerígenas; Punção/drenagem de ascite: Volume total acima de 250ml, para evitar impurezas e garantir a presença de células tumorais.

3.2 Transporte em cadeia de frio As amostras de tumor coletadas devem ser armazenadas em gelo a 2-8 ℃ por 24 horas e entregues ao laboratório.

3.3 Teste de sensibilidade a medicamentos em modelo de órgão

1. Cultura Organoide I Obtenção de Suspensão Celular

   ① Suspensão de células tumorais: Após a remoção do tecido necrótico, tecido adiposo e tecido fibroso da amostra, a amostra efetiva é cortada em fragmentos de tecido tumoral com diâmetro de 1 mm e, em seguida, os fragmentos de tecido são digeridos usando solução de dissociação de tecido. Use um filtro estéril de 70-100 μM para filtrar o tecido digerido e o filtrado é centrifugado por 5 minutos antes de descartar o sobrenadante. Use lisase de glóbulos vermelhos para lisar os glóbulos vermelhos na suspensão, centrifugar e suspender o precipitado usando PBS.

   • Suspensão de células de fluido maligno: usando filtro estéril de 70-100 μM é usado para filtrar fluido maligno, remover suspensão sólida, centrifugar e suspender o precipitado usando PBS.

   II Verificação da viabilidade celular: Use o método de coloração com azul tripano para observar a viabilidade celular e garantir que a proporção de células vivas seja superior a 80%.

2. Estabelecimento de organoides Espalhe o gel de matriz mista de células tumorais vivas uniformemente na placa de cultura pré-preparada, adicione meio de cultura celular adequado e, em seguida, coloque-o em uma incubadora de 37 ℃ e 5% de CO₂ para cultivo estático.
3. Verificação da taxa de organogênese Testes patológicos, genéticos e validação imuno-histoquímica são realizados em amostras de organoides cultivados com sucesso para confirmar a construção bem-sucedida de organoides tumorais. Se a validação for para tecido normal, a amostra falha e o feedback oportuno é fornecido ao médico da amostragem clínica.
4. Verificação de sensibilidade de medicamentos organoides Após cultivo bem-sucedido, os organoides foram divididos nos seguintes quatro grupos: grupo zerar (excluindo organoides, contendo apenas meio de cultura celular); Controle negativo (organoide+solvente da droga); Controle positivo (organoide+astrosporina); Grupo de teste de sensibilidade a medicamentos (organoide+medicamento teste); Cada grupo possui três poços, e o medicamento selecionado para teste de sensibilidade aos medicamentos é baseado nas recomendações dos pesquisadores e nas diretrizes de diagnóstico e tratamento da Sociedade Chinesa de Oncologia Clínica. A dose clínica é usada como base e três concentrações de alta, média e baixa são definidas com um gradiente de 3 vezes.
5. Teste de viabilidade celular A viabilidade celular foi medida usando tecnologia de detecção de sensibilidade a drogas por biofluorescência de ATP (ATP-TCA). O complexo de pigmento fluorescente e enzima fluorescente pode sofrer uma reação química com a participação do ATP para produzir fluorescência. A intensidade de fluorescência emitida reflete o conteúdo de ATP, que por sua vez reflete o número de células vivas. A tecnologia de detecção de sensibilidade a medicamentos por biofluorescência de ATP usa o conteúdo intracelular de ATP como ponto final para medir a atividade celular, que pode medir as diferenças entre diferentes medicamentos e o mesmo medicamento em diferentes concentrações.
6. Aquisição de indicadores de sensibilidade a medicamentos Taxa de inibição de crescimento semelhante a órgão: A taxa de inibição (IR) de diferentes concentrações de medicamentos em organoides.

Avaliação da sensibilidade ao medicamento: A taxa de inibição do crescimento do medicamento em organoides na concentração de ação clínica é usada como um indicador de sensibilidade dos organoides tumorais aos medicamentos. Uma taxa de inibição inferior a 20 indica que os organoides são resistentes à droga, uma taxa de inibição de 20-40 indica sensibilidade leve, uma taxa de inibição de 40-70 indica sensibilidade moderada e uma taxa de inibição superior a 70 indica que os organoides são altamente sensíveis à droga.

O suporte técnico acima é fornecido por uma plataforma técnica profissional terceirizada: Avaliação de medicamentos de biomassa de Xangai/Centro de testes de produtos de saúde de Luzhou; O tempo para emissão dos resultados de sensibilidade aos medicamentos é de cerca de 2 semanas. Os testes de sensibilidade aos medicamentos dos tumores estromais gastrointestinais serão realizados com base nos resultados da exploração do método de cultura 3D e acordados com a unidade principal do projeto.

3.4 Desenvolvimento de planos de medicação Construir um modelo organoide tumoral com base em amostras de biópsia e desenvolver um plano de tratamento baseado em resultados de sensibilidade a medicamentos organoides, combinados com diretrizes de diagnóstico e tratamento/consenso de especialistas e experiência clínica de pesquisadores.

O plano geral de tratamento para todos os sujeitos é formulado pelos pesquisadores do subcentro com base em sua condição.

4.Procedimentos de pesquisa Este estudo está dividido em quatro partes: período de triagem, período de planejamento, período de observação do tratamento e período de acompanhamento da progressão.

5. Avaliação da eficácia Após o tratamento, avalie e compare tumores da mesma categoria. 5.1Indicadores de avaliação de eficácia

• Compare as diferenças entre os resultados de sensibilidade aos medicamentos organoides e os planos de tratamento recomendados com base em diretrizes/consenso; ② Mudanças nas lesões-alvo em comparação com a linha de base após 3 ciclos de tratamento medicamentoso: tomografia computadorizada de tórax e abdômen ou ressonância magnética ou PET-CT;

  • Taxa de recorrência; Com base nas informações de acompanhamento do paciente; ④ Tempo médio de sobrevida livre de progressão e tempo médio de sobrevida dos pacientes: combinado com as informações do ciclo de cada tumor durante o acompanhamento do paciente.

5.2 Critérios para determinação da eficácia

A eficácia é avaliada de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) para tumores sólidos:

• Resposta completa (CR): Todas as lesões-alvo desaparecem e os valores do eixo curto de todos os linfonodos patológicos são inferiores a 10 mm;

  • Resposta parcial (RP): refere-se à soma dos raios críticos, com redução mínima de 30% na soma de todos os raios da lesão alvo; ③ Doença estável (DP): refere-se ao valor mínimo do total de lesões-alvo observadas, que não atende aos critérios de progressão e também não atende aos critérios de remissão; ④ Doença progressiva (DP): O valor mínimo do total de lesões-alvo observadas, o aumento mínimo de 20% no raio total de todas as lesões-alvo e o valor absoluto do aumento total no raio das lesões-alvo> 5 mm. Cálculo: Taxa efetiva após tratamento=(CR+PR)/número total de casos x 100,0%; A taxa de resposta objetiva (OR) inclui CR+PR confirmados com pelo menos 4 semanas de intervalo; A taxa de controle da doença (DCR) inclui remissão tumoral confirmada (CR+PR) e pacientes que foram registrados como SD após pelo menos 4 semanas de uso do medicamento, ou seja, CR+PR+SD.

    • Recorrência do tumor: Durante o exame de imagem após o tratamento, constatou-se que o tumor se expandiu novamente 6 meses após a remissão parcial, e novos tumores foram encontrados em outras partes ou áreas distantes da lesão primária; Após 6 meses de remissão completa, a recorrência do tumor (incluindo recorrência local, recorrência regional e recorrência à distância) foi descoberta através de exame de imagem.