Исследование корреляции между тестированием чувствительности к органоидным лекарствам и точным лечением опухолей желудочно-кишечного тракта

Это исследование представляет собой одногрупповое многоцентровое открытое проспективное клиническое исследование.

1. Размер выборки Это исследование является клиническим исследовательским и не оценивает размер выборки. Ожидается, что в него войдут 68 пациентов с опухолями пищеварительного тракта, в том числе по 16 случаев рака пищевода, рака желудка и колоректального рака, а также 20 случаев стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта.

1.1 Центр участия Примерно 10-15 исследовательских центров участвуют по всей стране. 2. Выбор случая 2.1 Критерии выбора

Для выбора должны быть выполнены все следующие условия:

1. Возрастной диапазон от 18 до 75 лет независимо от пола;
2. Пациенты с раком пищевода, раком желудка, колоректальным раком и стромальными опухолями желудочно-кишечного тракта, подтвержденными гистопатологией/цитологией;

3. Состояние субъекта соответствует одному из следующих условий:

   Рак пищевода: клиническая стадия — стадия II (cT1-2N1-3M0/cT3-4NOMO) или стадия III (cT3-4aN1-3MO); Рак желудка: клиническая стадия — стадия II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) или стадия III (cT3-4aN1-3MO); Колоректальный рак: клиническая стадия — стадия II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) или стадия III (cT3-4aN1-3MO). Желудочно-кишечные стромальные опухоли: первичные стромальные опухоли с местно-распространенной классификацией риска (спонтанный разрыв опухоли; диаметр опухоли). >10 см; митотическое изображение >10/5 мм)²; Диаметр опухоли>5 см и количество митозов>5/5 мм²; 5 см ≤ диаметр опухоли> 2 см и митотическое изображение> 5/5 мм ² Нежелудочный первичный; 10 см ≤ диаметр опухоли > 5 см и митотическое изображение ≤ 5/5 мм² (непервичная стромальная опухоль желудка) или рецидивирующая метастатическая/неоперабельная стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта.

4. Пациент или законный представитель добровольно участвует в этом исследовании и подписывает 2.2 Критерии исключения.

В это испытание не может быть включена одна из следующих ситуаций:

1. Страдающие системными воспалительными заболеваниями и/или нарушениями свертываемости крови;
2. Имеются серьезные заболевания печени и почек, сердечно-сосудистые заболевания, заболевания органов дыхания или неконтролируемый диабет;
3. Страдающие другими злокачественными опухолями системы;
4. Пациенты с психическими заболеваниями, которые не могут сотрудничать при завершении исследования;
5. Известная аллергия на потенциальные химиотерапевтические препараты или хирургические противопоказания;
6. Больные, состояние которых невозможно обратить вспять или находящиеся в предсмертном состоянии;
7. Невозможно получить достаточное количество опухолевой ткани с помощью биопсии для органоидной культуры и гистологического анализа;
8. Беременность или кормление грудью, или планирование плана зачатия в течение следующих 6 месяцев;
9. Плохое состояние здоровья, показатель KPS <70 баллов или показатель ECOG ≥ 3 баллов;
10. Получение любого другого противоракового лекарственного лечения, биологической терапии, лучевой терапии или иммуносупрессивной терапии в течение 4 недель; 3.Метод исследования 3.1Отбор образцов опухолевых органов Свежая ткань, образец соответствующего и достаточного размера, постарайтесь полностью удалить нормальную ткань, чтобы уменьшить помехи.

Эндоскопическая биопсия: возьмите щипцами 3 или более кусочков общим объемом ≥ 0,5 г и соберите участки, богатые раковыми клетками; Пункционная биопсия: общей длиной ≥ 3 см (каждый кусочек 1 см и более, всего 3 кусочка) собирают участки, богатые раковыми клетками; Пункция/дренирование асцита: общий объем более 250 мл, чтобы избежать примесей и убедиться в наличии опухолевых клеток.

3.2 Транспортировка в холодовой цепи. Собранные образцы опухолей следует хранить на льду при температуре 2–8 ℃ в течение 24 часов и доставлять в лабораторию.

3.3 Тестирование чувствительности к лекарственным препаратам на моделях органов

1. Органоидная культура I. Получение клеточной суспензии.

   ① Суспензия опухолевых клеток: после удаления некротической ткани, жировой ткани и фиброзной ткани из образца эффективный образец разрезается на фрагменты опухолевой ткани диаметром 1 мм, а затем фрагменты ткани перевариваются с использованием раствора для диссоциации тканей. Используйте стерильный фильтр 70-100 мкм, фильтрующий переваренную ткань, и фильтрат центрифугируют в течение 5 минут, прежде чем выбрасывать супернатант. Используйте лизазу эритроцитов, чтобы лизировать эритроциты в суспензии, центрифугируйте и суспендируйте осадок с помощью PBS.

   • Суспензия клеток злокачественной жидкости: для фильтрации злокачественной жидкости используют стерильный фильтр 70-100 мкм, удаляют твердую суспензию, центрифугируют и суспендируют осадок с помощью PBS.

   II Проверка жизнеспособности клеток: используйте метод окрашивания трипановым синим, чтобы оценить жизнеспособность клеток и убедиться, что доля живых клеток превышает 80%.

2. Создание органоидов Равномерно распределите смешанный матричный гель живых опухолевых клеток на предварительно подготовленную культуральную пластину, добавьте подходящую среду для культивирования клеток, а затем поместите ее в инкубатор с температурой 37 ℃, 5% CO ₂ для статического культивирования.
3. Проверка скорости органогенеза Патологическое, генетическое тестирование и иммуногистохимическая проверка выполняются на образцах успешно культивированных органоидов для подтверждения успешного создания опухолевых органоидов. Если валидация проводится для нормальной ткани, образец не пройден, и врачу, производящему клинический отбор проб, предоставляется своевременная обратная связь.
4. Проверка чувствительности органоидных препаратов. После успешного культивирования органоиды были разделены на следующие четыре группы: группа обнуления (исключая органоиды, содержащие только среду для культивирования клеток); Отрицательный контроль (органоид+растворитель лекарственного средства); Положительный контроль (органоид+астроспорин); Группа тестирования на чувствительность к лекарственному средству (органоид+тестируемый препарат); В каждой группе есть три лунки, и выбор препарата для тестирования на чувствительность к лекарству основан на рекомендациях исследователей и руководствах по диагностике и лечению Китайского общества клинической онкологии. В качестве основы используется клиническая доза, а три концентрации: высокая, средняя и низкая устанавливаются с 3-кратным градиентом.
5. Тестирование жизнеспособности клеток Жизнеспособность клеток измеряли с использованием технологии определения чувствительности к лекарственным средствам с помощью биофлуоресценции АТФ (АТФ-ТСА). Комплекс флуоресцентного пигмента и флуоресцентного фермента может вступать в химическую реакцию с участием АТФ с образованием флуоресценции. Интенсивность излучаемой флуоресценции отражает содержание АТФ, что, в свою очередь, отражает количество живых клеток. Технология определения чувствительности к лекарствам с помощью биофлуоресценции АТФ использует внутриклеточное содержание АТФ в качестве конечной точки для измерения активности клеток, что позволяет измерять различия между разными лекарствами и одним и тем же лекарством в разных концентрациях.
6. Получение показателей чувствительности к лекарственному средству. Органоподобная скорость ингибирования роста: Скорость ингибирования (IR) различных концентраций лекарственного средства на органоидах.

Оценка чувствительности к лекарственному средству: степень ингибирования роста органоидов препарата в концентрации клинического действия используется в качестве индикатора чувствительности органоидов опухоли к лекарственным средствам. Степень ингибирования менее 20 указывает на устойчивость органоидов к препарату, степень ингибирования 20–40 указывает на легкую чувствительность, степень ингибирования 40–70 указывает на умеренную чувствительность, а степень ингибирования более 70 указывает на высокую чувствительность органоидов. к препарату.

Вышеупомянутая техническая поддержка предоставляется сторонней профессиональной технической платформой: Шанхайским центром оценки лекарств из биомассы/Лучжоуским центром тестирования продуктов медицинского назначения; Срок выдачи результатов о лекарственной чувствительности составляет около 2 недель. Тестирование стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта на лекарственную чувствительность будет проводиться на основании результатов исследования методом 3D-культуры и согласовано с основным подразделением проекта.

3.4 Разработка планов лечения. Постройте органоидную модель опухоли на основе образцов биопсии и разработайте план лечения на основе результатов чувствительности к органоидным препаратам в сочетании с рекомендациями по диагностике и лечению/согласием экспертов и клиническим опытом исследователей.

Общий план лечения для всех субъектов формулируется исследователями субцентра с учетом их состояния.

4. Процедуры исследования. Это исследование разделено на четыре части: период скрининга, период планирования, период наблюдения за лечением и период наблюдения за прогрессированием.

5. Оценка эффективности. После лечения оцените и сравните опухоли одной и той же категории. 5.1 Показатели оценки эффективности

• Сравните различия между результатами чувствительности к органоидным препаратам и рекомендуемыми планами лечения, основанными на руководствах/консенсусах; ② Изменения целевых поражений по сравнению с исходным уровнем после 3 циклов лечения препаратом: КТ грудной клетки и брюшной полости, МРТ или ПЭТ-КТ;

  • Частота рецидивов; На основе информации о последующем наблюдении за пациентами; ④ Медианное время выживания без прогрессирования и медианное время выживаемости пациентов: в сочетании с информацией о цикле каждой опухоли во время наблюдения за пациентом.

5.2 Критерии определения эффективности

Эффективность оценивается по критериям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) для солидных опухолей:

• Полный ответ (CR): все целевые поражения исчезают, а размеры всех патологических лимфатических узлов по короткой оси составляют менее 10 мм;

  • Частичный ответ (PR): относится к сумме критического радиуса с минимальным уменьшением на 30% суммы всех целевых радиусов поражения; ③ Стабильное заболевание (SD): относится к минимальному значению общего наблюдаемого целевого поражения, которое не соответствует критериям прогрессирования, а также не соответствует критериям ремиссии; ④ Прогрессирующее заболевание (ПД): минимальное значение общего наблюдаемого целевого поражения, минимальное увеличение общего радиуса всех целевых поражений на 20% и абсолютное значение общего увеличения радиуса целевого поражения>5 мм. Расчет: Эффективная частота после лечения = (CR+PR)/общее количество случаев x 100,0%; Частота объективного ответа (OR) включает CR+PR, подтвержденный с интервалом не менее 4 недель; Показатель контроля заболевания (DCR) включает подтвержденную ремиссию опухоли (CR+PR) и пациентов, у которых зарегистрировано СД после как минимум 4 недель применения препарата, т.е. КР+ПР+СД.

    • Рецидив опухоли: во время визуализационного обследования после лечения было обнаружено, что опухоль снова увеличилась через 6 месяцев после частичной ремиссии, а новые опухоли рецидивировали в других частях или отдаленных областях первичного поражения; Через 6 месяцев полной ремиссии с помощью визуализационного обследования был обнаружен рецидив опухоли (включая местный рецидив, регионарный рецидив и отдаленный рецидив).