Forschung zum Zusammenhang zwischen organoiden Arzneimittelempfindlichkeitstests und der präzisen Behandlung von Magen-Darm-Tumoren

Bei dieser Studie handelt es sich um eine einarmige, multizentrische, offene, prospektive klinische Studie.

1. Stichprobengröße Bei dieser Studie handelt es sich um eine klinische explorative Studie und es wird keine Schätzung der Stichprobengröße vorgenommen. Es wird erwartet, dass 68 Patienten mit Tumoren des Verdauungstrakts eingeschlossen werden, darunter jeweils 16 Fälle von Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs und Darmkrebs sowie 20 Fälle von gastrointestinalen Stromatumoren.

1.1Beteiligungszentrum Bundesweit sind ca. 10-15 Forschungszentren beteiligt. 2.Fallauswahl 2.1Auswahlkriterien

Um ausgewählt zu werden, müssen alle folgenden Bedingungen erfüllt sein:

1. Altersspanne von 18 bis 75 Jahren, unabhängig vom Geschlecht;
2. Patienten mit Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs, Darmkrebs und gastrointestinalen Stromatumoren, bestätigt durch Histopathologie/Zytologie;

3. Der Zustand des Probanden erfüllt eine der folgenden Bedingungen:

   Speiseröhrenkrebs: klinisches Stadieneinteilung ist Stadium II (cT1-2N1-3M0/cT3-4NOMO) oder Stadium III (cT3-4aN1-3MO); Magenkrebs: Klinisches Stadieneinteilung ist Stadium II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) oder Stadium III (cT3-4aN1-3MO); Darmkrebs: klinisches Stadieneinteilung ist Stadium II (cT1-2N1-3M0/cT3-4N0MO) oder Stadium III (cT3-4aN1-3MO) Gastrointestinale Stromatumoren: Primäre Stromatumoren mit lokal fortgeschrittener Risikoklassifizierung (spontane Ruptur des Tumors; Tumordurchmesser). >10cm; Mitosebild>10/5mm)²; Tumordurchmesser > 5 cm und Mitosezahl > 5/5 mm²; 5 cm ≤ Tumordurchmesser > 2 cm und mitotisches Bild > 5/5 mm² Nicht gastrische Primärerkrankung; 10 cm ≤ Tumordurchmesser > 5 cm und mitotisches Bild ≤ 5/5 mm² (nicht primärer Magenstromatumor) oder rezidivierender metastasierter/nicht resezierbarer gastrointestinaler Stromatumor.

4. Der Patient oder gesetzliche Vertreter nimmt freiwillig an dieser Studie teil und unterschreibt 2.2 Ausschlusskriterien

Eine der folgenden Situationen kann in dieser Studie nicht berücksichtigt werden:

1. Leiden an systemischen entzündlichen Erkrankungen und/oder Gerinnungsstörungen;
2. Es liegen schwere Leber- und Nierenerkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Atemwegserkrankungen oder unkontrollierter Diabetes vor;
3. Leiden an anderen bösartigen Tumoren des Systems;
4. Patienten mit psychischen Erkrankungen, die nicht in der Lage sind, am Abschluss der Studie mitzuarbeiten;
5. Bekannte Allergien gegen potenzielle Chemotherapeutika oder chirurgische Kontraindikationen;
6. Patienten, deren Zustand nicht rückgängig gemacht werden kann oder die sich im Sterben befinden;
7. Es ist nicht möglich, durch eine Biopsieoperation ausreichend Tumorgewebe für die Organoidkultur und histologische Analyse zu gewinnen;
8. Schwangerschaft oder Stillzeit oder die Planung eines Fruchtbarkeitsplans innerhalb der nächsten 6 Monate;
9. Schlechter Gesundheitszustand, KPS-Score <70 Punkte oder ECOG-Score ≥ 3 Punkte;
10. Erhalt einer anderen medikamentösen Krebsbehandlung, biologischen Therapie, Strahlentherapie oder immunsuppressiven Therapie innerhalb von 4 Wochen; 3. Forschungsmethode 3.1 Sammlung von Tumororganproben Frisches Gewebe, geeignete und ausreichende Probengröße. Versuchen Sie, normales Gewebe vollständig zu entfernen, um Störungen zu reduzieren.

Endoskopische Biopsie: Nehmen Sie mit einer Pinzette 3 oder mehr Stücke mit einer Gesamtmenge von ≥ 0,5 g und sammeln Sie reiche Bereiche mit Krebszellen. Punktionsbiopsie: Mit einer Gesamtlänge von ≥ 3 cm (jedes Stück ist 1 cm oder mehr, insgesamt 3 Stück) sammeln Sie reiche Bereiche mit Krebszellen. Aszitespunktion/Drainage: Gesamtvolumen über 250 ml, um Verunreinigungen zu vermeiden und das Vorhandensein von Tumorzellen sicherzustellen.

3.2 Kühlkettentransport Die entnommenen Tumorproben sollten 24 Stunden lang bei 2–8 °C auf Eis gelagert und an das Labor geliefert werden.

3.3 Prüfung der Arzneimittelempfindlichkeit im Organmodell

1. Organoidkultur I Gewinnung einer Zellsuspension

   ① Tumorzellsuspension: Nach der Entfernung von nekrotischem Gewebe, Fettgewebe und fibrösem Gewebe aus der Probe wird die wirksame Probe in Tumorgewebefragmente mit einem Durchmesser von 1 mm geschnitten und anschließend werden die Gewebefragmente mit einer Gewebedissoziationslösung verdaut. Verwenden Sie den Sterilfilter von 70–100 μ M, um das verdaute Gewebe zu filtern. Das Filtrat wird 5 Minuten lang zentrifugiert, bevor der Überstand verworfen wird. Verwenden Sie Lysase der roten Blutkörperchen, um die roten Blutkörperchen in der Suspension zu lysieren, zentrifugieren Sie und suspendieren Sie den Niederschlag mit PBS.

   • Zellsuspension mit bösartiger Flüssigkeit: Mithilfe eines 70–100 μM sterilen Filters wird die bösartige Flüssigkeit gefiltert, die feste Suspension entfernt, zentrifugiert und der Niederschlag mit PBS suspendiert.

   II Überprüfung der Lebensfähigkeit der Zellen: Verwenden Sie die Trypanblau-Färbemethode, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beobachten und sicherzustellen, dass der Anteil lebender Zellen mehr als 80 % beträgt.

2. Etablierung von Organoiden Verteilen Sie das gemischte Matrixgel aus lebenden Tumorzellen gleichmäßig auf der vorbereiteten Kulturplatte, fügen Sie geeignetes Zellkulturmedium hinzu und legen Sie es dann zur statischen Kultivierung in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂.
3. Überprüfung der Organogeneserate An Proben erfolgreich kultivierter Organoide werden pathologische Tests, genetische Tests und eine immunhistochemische Validierung durchgeführt, um die erfolgreiche Konstruktion von Tumororganoiden zu bestätigen. Wenn sich die Validierung auf normales Gewebe bezieht, schlägt die Probe fehl und der klinische Probenentnahmearzt erhält rechtzeitig eine Rückmeldung.
4. Empfindlichkeitsüberprüfung von Organoid-Arzneimitteln Nach erfolgreicher Kultivierung wurden die Organoide in die folgenden vier Gruppen eingeteilt: Nullungsgruppe (ohne Organoide, nur mit Zellkulturmedium); Negativkontrolle (Organoid + Arzneimittellösungsmittel); Positivkontrolle (Organoid+Astrosporin); Gruppe für Arzneimittelsensitivitätstests (Organoid + Testmedikament); Jede Gruppe verfügt über drei Vertiefungen, und das ausgewählte Medikament für den Medikamentensensitivitätstest basiert auf den Empfehlungen der Forscher und den Diagnose- und Behandlungsrichtlinien der Chinesischen Gesellschaft für Klinische Onkologie. Als Basis dient die klinische Dosis und es werden drei Konzentrationen hoch, mittel und niedrig mit einem 3-fachen Gradienten eingestellt.
5. Testen der Zelllebensfähigkeit Die Zelllebensfähigkeit wurde mithilfe der ATP-Biofluoreszenz-Wirkstoffsensitivitätserkennungstechnologie (ATP-TCA) gemessen. Der Komplex aus fluoreszierendem Pigment und fluoreszierendem Enzym kann unter Beteiligung von ATP eine chemische Reaktion eingehen, um Fluoreszenz zu erzeugen. Die emittierte Fluoreszenzintensität spiegelt den ATP-Gehalt wider, der wiederum die Anzahl der lebenden Zellen widerspiegelt. Die ATP-Biofluoreszenz-Arzneimittelsensitivitätserkennungstechnologie nutzt den intrazellulären ATP-Gehalt als Endpunkt für die Messung der Zellaktivität, wodurch die Unterschiede zwischen verschiedenen Arzneimitteln und demselben Arzneimittel in unterschiedlichen Konzentrationen gemessen werden können.
6. Erfassung von Arzneimittelsensitivitätsindikatoren Organähnliche Wachstumshemmungsrate: Die Hemmungsrate (IR) verschiedener Arzneimittelkonzentrationen auf Organoiden.

Beurteilung der Arzneimittelempfindlichkeit: Die Wachstumshemmungsrate des Arzneimittels auf Organoiden bei klinischer Wirkungskonzentration wird als Empfindlichkeitsindikator für Tumororganoide gegenüber Arzneimitteln verwendet. Eine Hemmungsrate von weniger als 20 zeigt an, dass Organoide resistent gegen das Arzneimittel sind, eine Hemmungsrate von 20–40 weist auf eine leichte Empfindlichkeit hin, eine Hemmungsrate von 40–70 weist auf eine mäßige Empfindlichkeit hin und eine Hemmungsrate über 70 zeigt an, dass Organoide hochempfindlich sind zur Droge.

Der oben genannte technische Support wird von einer professionellen technischen Plattform eines Drittanbieters bereitgestellt: Shanghai Biomass Drug Evaluation/Luzhou Health Product Testing Center; Die Zeit bis zur Veröffentlichung der Ergebnisse zur Arzneimittelsensitivität beträgt etwa 2 Wochen. Die Arzneimittelsensitivitätsprüfung von gastrointestinalen Stromatumoren wird auf der Grundlage der Explorationsergebnisse der 3D-Kulturmethode durchgeführt und mit der Haupteinheit des Projekts abgestimmt.

3.4 Entwicklung von Medikationsplänen Erstellen Sie ein Tumor-Organoid-Modell auf der Grundlage von Biopsieproben und entwickeln Sie einen Behandlungsplan auf der Grundlage der Ergebnisse zur Empfindlichkeit gegenüber Organoid-Arzneimitteln, kombiniert mit Diagnose- und Behandlungsrichtlinien/Expertenkonsens und klinischer Erfahrung von Forschern.

Der Gesamtbehandlungsplan für alle Probanden wird von den Forschern des Unterzentrums auf der Grundlage ihres Zustands formuliert.

4. Forschungsverfahren Diese Studie ist in vier Teile unterteilt: Screening-Zeitraum, Planungszeitraum, Behandlungsbeobachtungszeitraum und Fortschritts-Follow-up-Zeitraum.

5. Wirksamkeitsbewertung: Bewerten und vergleichen Sie nach der Behandlung Tumoren derselben Kategorie. 5.1 Indikatoren zur Wirksamkeitsbewertung

• Vergleichen Sie die Unterschiede zwischen den Ergebnissen zur Organoid-Arzneimittelsensitivität und den empfohlenen Behandlungsplänen basierend auf Leitlinien/Konsens; ② Veränderungen der Zielläsionen im Vergleich zum Ausgangswert nach 3 medikamentösen Behandlungszyklen: Brust- und Bauch-CT oder MRT oder PET-CT;

  • Wiederholungsrate; Basierend auf Patienten-Follow-up-Informationen; ④ Mittlere progressionsfreie Überlebenszeit und mittlere Überlebenszeit der Patienten: kombiniert mit den Zyklusinformationen jedes Tumors während der Patientennachbeobachtung.

5.2 Kriterien zur Bestimmung der Wirksamkeit

Die Wirksamkeit wird nach den Kriterien der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für solide Tumoren bewertet:

• Vollständige Remission (CR): Alle Zielläsionen verschwinden und die Kurzachsenwerte aller pathologischen Lymphknoten betragen weniger als 10 mm;

  • Partielle Reaktion (PR): bezieht sich auf die Summe des kritischen Radius mit einer Mindestverringerung von 30 % in der Summe aller Zielläsionsradien; ③ Stabile Erkrankung (SD): bezieht sich auf den Mindestwert der insgesamt beobachteten Zielläsionen, der die Progressionskriterien und auch nicht die Remissionskriterien erfüllt; ④ Progressive Erkrankung (PD): Der Mindestwert der insgesamt beobachteten Zielläsionen, die Mindestzunahme des Gesamtradius aller Zielläsionen um 20 % und der absolute Wert der Gesamtzunahme des Radius der Zielläsionen > 5 mm. Berechnung: Effektive Rate nach der Behandlung = (CR+PR)/Gesamtzahl der Fälle x 100,0 %; Die objektive Rücklaufquote (OR) umfasst CR+PR, die im Abstand von mindestens 4 Wochen bestätigt wurden; Die Krankheitskontrollrate (DCR) umfasst eine bestätigte Tumorremission (CR+PR) und Patienten, die nach mindestens 4 Wochen Drogenkonsum als SD erfasst wurden, d. h. CR+PR+SD.

    • Wiederauftreten des Tumors: Bei der bildgebenden Untersuchung nach der Behandlung wurde festgestellt, dass sich der Tumor 6 Monate nach der teilweisen Remission erneut ausdehnte und dass neue Tumoren in anderen Teilen oder entfernten Bereichen der primären Läsion wieder auftraten; Nach 6 Monaten vollständiger Remission wurde durch bildgebende Untersuchung ein Tumorrezidiv (einschließlich Lokalrezidiv, Regionalrezidiv und Fernrezidiv) entdeckt.