Innhenting av udifferensierte celler fra testisbiopsi

Testikkelbiopsier ble innhentet fra azoospermiske pasienter som en del av deres diagnose og opparbeidelse etter å ha innhentet et signert informert samtykke. En del av hver prøve ble mekanisk dissekert i PBS med 1% Pen/Strep. For enzymatisk fordøyelse ble prøver inkubert med 0,5 g/ml kollagenase type 1A i 20 minutter og TripLE Select i 15 minutter ved 37 ºC på en shaker og deretter filtrert med 30 µm og sentrifugert ved 1000 rpm. Pelletene ble sådd og inkubert i embryonale stamcellemedier (hESC) med glialcellelinjeavledet nevrotrofisk faktor (GDNF 4ng/mL) i 5-7 dager ved 37ºC (1. kultur). For å identifisere og isolere SSC-er ble de merket med CD49f-antistoff og FACS-sortert. Positive celler ble dyrket i gelatinplater som inneholdt hESC-medier med leukemihemmende faktor (LIF1000U/ml) (2. kultur).