Obtención de células indiferenciadas a partir de biopsia testicular

Se obtuvieron biopsias testiculares de pacientes azoospérmicos como parte de su diagnóstico y evaluación después de obtener un consentimiento informado firmado. Una porción de cada muestra se diseccionó mecánicamente en PBS con Pen/Strep al 1%. Para la digestión enzimática, las muestras se incubaron con 0,5 g/ml de colagenasa tipo 1A durante 20 min y TripLE Select durante 15 min a 37 ºC en un agitador y luego se filtraron con 30 µm y se centrifugaron a 1000 rpm. Los sedimentos se sembraron y se incubaron en medio de células madre embrionarias (hESC) con factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (GDNF 4 ng/mL) durante 5-7 días a 37 ºC (primer cultivo). Para identificar y aislar las SSC, se marcaron con anticuerpo CD49f y se clasificaron mediante FACS. Las células positivas se cultivaron en placas de gelatina que contenían medio hESC con factor inhibidor de leucemia (LIF1000U/mL) (segundo cultivo).