Uzyskanie niezróżnicowanych komórek z biopsji jąder

Biopsje jąder pobierano od pacjentów z azoospermią w ramach diagnostyki i opracowania po uzyskaniu podpisanej świadomej zgody. Część każdej próbki preparowano mechanicznie w PBS z 1% Pen/Strep. Do trawienia enzymatycznego próbki inkubowano z 0,5 g/ml kolagenazy typu 1A przez 20 minut i TripLE Select przez 15 minut w temperaturze 37°C na wytrząsarce, a następnie przesączono przez 30 µm i odwirowano przy 1000 obr./min. Osady wysiano i inkubowano w pożywce embrionalnych komórek macierzystych (hESC) z czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z linii komórek glejowych (GDNF 4 ng/ml) przez 5-7 dni w temperaturze 37°C (pierwsza hodowla). Aby zidentyfikować i wyizolować SSC, oznaczono je przeciwciałem CD49f i posortowano FACS. Komórki pozytywne hodowano na płytkach żelatynowych zawierających pożywkę hESC z czynnikiem hamującym białaczkę (LIF1000 U/ml) (druga hodowla).