Flytende biopsi for ctDNA i peritoneal lavage og blod i bukspyttkjertelkreft (LIPAC)

1. Innledning Omtrent 1.000 nye tilfeller av kreft i bukspyttkjertelen (PC) blir diagnostisert hvert år i Danmark. Duktalt adenokarsinom er den desidert hyppigste histologiske undertypen av kreft i bukspyttkjertelen og utgjør mer enn 90 % av alle tilfeller [1]. I denne protokollen refererer begrepet PC til duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen. PC er en ødeleggende sykdom med en total 5-års overlevelse på 3-7 % [2]. Mindre enn én av fire pasienter er kandidater for tiltenkt kurativ reseksjon, men selv etter mikroskopisk radikal reseksjon (R0-reseksjon) vil flertallet av pasientene få tilbakevendende sykdom innen 2 år [3]. Avviket mellom patologisk vurdering og klinisk utfall indikerer at de fleste pasienter vil ha ikke-oppdaget (dvs. okkulte) kreftceller på reseksjonstidspunktet.

   Det er av ytterste viktighet å forbedre vår evne til prognose og prediksjon av PC, med sikte på en skreddersydd og personlig tilnærming for behandlingsbeslutninger angående denne aggressive krefttypen. Dette prosjektet tar sikte på å ta et viktig skritt i denne retningen, ved en 2-lags tilnærming: 1) Undersøkelse av det perifere blodet (deteksjon av sirkulerende tumor-DNA), og 2) den peritoneale skyllevæsken (deteksjon av tumor-DNA i peritonealrommet) ).

2. Bakgrunn PC er en dødelig sykdom og kirurgisk reseksjon av svulsten er det eneste håpet om kur. Omtrent 20-25 % av PC-pasientene er kandidater for tiltenkt kurativ reseksjon på diagnosetidspunktet, men til tross for mikroskopisk radikal reseksjon vil flertallet av pasientene ha residiverende sykdom innen 2 år [3]. Dette indikerer at de fleste pasienter vil huse ikke-oppdaget (dvs. okkulte) kreftceller på reseksjonstidspunktet. Studier tyder på at frie tumorceller i bukhinnen og i blodet er en del av denne okkulte sykdomsbyrden, og at pasienter med slike funn ikke bør opereres, men behandles som å ha metastatisk sykdom. Den nøyaktige forekomsten av disse tumorcellene i en uselektert gruppe pasienter som gjennomgår bukspyttkjertelreseksjon er imidlertid ukjent, og den potensielle innvirkningen på postoperativ overlevelse er også usikker. De siste årene har molekylære biomarkører i økende grad blitt sett på som både prediktive og prognostiske verktøy for kreftpasienter. Denne studien vil bruke de mest optimale tilgjengelige metodene for å undersøke forekomsten av tumorceller i peritoneum og blod hos PC-pasienter, og for å relatere disse funnene til det endelige utfallet av de resekerte pasientene. Dette prosjektet har blitt svært relevant siden nye behandlingsmetoder (dvs. Trykksatt intraperitoneal aerosolkjemoterapi (PIPAC)) kan brukes til å utrydde frie tumorceller.

2.1 Positiv peritonealskylling indikerer dårlig prognose hos PC-pasienter Okkulte maligne celler kan påvises i væske oppnådd ved peritoneal lavage (PLF) under stadielaparoskopi, åpen kirurgi eller prøvetaking fra postoperativ drenvæske hos pasienter med PC. De ondartede cellene diagnostiseres ved konvensjonell cytologi kombinert med immunocytologi, men sanntids polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) av CEA kan øke deteksjonshastigheten av okkulte ondartede celler i peritoneal skyllevæske [4]. De fleste datarapporter om bruk av CEA [4], men også evaluering av EpCAM har vært gjenstand for interesse. En fersk studie rapporterte kombinasjonen av CEA/EpCAM mRNA som et optimalisert oppsett for påvisning av frie intraperitoneale tumorceller av ulik opprinnelse med høy sensitivitet og utmerket spesifisitet [5]. En annen markør, CA 19-9, har fått interesse, men mest i studier som inkluderer magekreftpasienter og presenterer resultatene i proteinnivåer i stedet for mRNA. Disse studiene tyder på at forhøyede nivåer av CA 19-9 i PL er assosiert med mer avanserte stadier av sykdom, er en mer pålitelig prediktiv faktor for stadieinndeling enn serum CA 19-9 nivåer og er en mer sensitiv markør enn CEA [6, 7] .

Mens mRNA- og proteinbaserte analyser har vist lovende resultater, eksisterer bare kasuistiske data om påvisning av KRAS-mutasjoner i PLF [8-10]. I en norsk studie inkludert pasienter reseksjonert for endetarmskreft ble det imidlertid funnet KRAS-mutasjoner i PLF samlet umiddelbart etter operasjon hos 19 av 237 pasienter. Disse KRAS-positive pasientene hadde betydelig dårligere overlevelse [11], og lignende resultater kan også bli funnet hos pasienter resekert for PC.

En fersk systematisk oversikt og meta-analyse viste at PC-pasienter med positiv peritoneal cytologi (Cy+) hadde en betydelig dårligere overlevelse enn pasienter med negativ peritonealcytologi (Cy-)(HR 3.18), og forfatterne konkluderte med at Cy+-pasienter ikke skulle opereres. [12]. Denne konklusjonen ble støttet av en signifikant lavere total overlevelse og en høyere peritoneal residivrate etter reseksjon av Cy+-pasienter sammenlignet med Cy-pasienter [13]. Enighet om at Cy+ i resektabel PDAC er en negativ prediktor for prognose kom fra en annen fersk metaanalyse og systematisk oversikt. Denne studien indikerte imidlertid også at median OS var verre hos pasienter uten enn hos de med reseksjon blant pasienter med Cy+, og understreket dermed behovet for ytterligere nøye vurdering av indikasjoner for radikal reseksjon hos Cy+-pasienter [14]. I tillegg bør det bemerkes at manipulasjon av svulst under kirurgi øker frekvensen av pasienter med positiv PLF (basert på EpCAM mRNA-målinger) betydelig fra 10 % til 54 %, selv om denne studien ikke var i stand til å oppdage en dårligere prognose hos EpCAM positive pasienter [ 3].

Til tross for slike bevis inkluderer de fleste internasjonale retningslinjer ikke peritoneal lavage og cytologi, proteinanalyse eller RT-PCR som en del av den preoperative evalueringen av PC-pasienter. Denne observasjonen kan forklares med den retrospektive opprinnelsen til de fleste av disse (hovedsakelig japanske) dataene, mangel på ensartethet med hensyn til definisjon av metoder brukt for analyse av PLF, mangel på studier som evaluerer preoperativ behandling av PLF+-pasienter, og en generell motvilje mot å akseptere at flertallet av resektable PC-pasienter har spredt sykdom på diagnosetidspunktet.

2.2 Sirkulerende tumor-DNA (ctDNA) i blodet er en markør for dårlig prognose hos PC-pasienter Det er gjort store forbedringer i forståelsen av den molekylære karsinogenesen og det genetiske landskapet til PC. En viktig milepæl er avsløringen av fire vanlige drivergener i PC-karsinogenese. KRAS er mutert i 90-95 %, og er derfor det mest muterte genet hos PC-pasienter, etterfulgt av mindre hyppige mutasjoner i TP53 (50 %), SMAD4 (19 %) og CDKN2A/P16 (6 %) [15, 16 ]. Interessant nok er det også påvist KRAS-mutasjoner i sirkulerende tumor-DNA (ctDNA) i blodet (flytende biopsier) fra pasienter med metastatisk PC, og ctDNA regnes som en markør for dårlig prognose [17]. Tilsvarende ble KRAS-mutasjoner funnet i plasma til en tredjedel av pasienter med en resektabel svulst, og ctDNA-positive (ctDNA+) pasienter hadde en signifikant dårligere total overlevelse (13,6 måneder vs 27,6 måneder, p<0,0001) [18]. Lignende konklusjoner ble trukket i nyere systematiske oversikter og metaanalyser [19,20], mens en studie ikke klarte å bekrefte disse resultatene. Påvisningen av KRAS-mutasjoner i cellefritt DNA har også blitt identifisert som en prognostisk biomarkør hos PC-pasienter [21]. Dessuten er kombinasjonen av KRAS-mutasjonsanalyse og CA 19-9-analyse nyttig for påvisning og prognostisk evaluering av bukspyttkjertelkarsinom. Hvis man ser på studier inkludert alle stadier av PC-pasienter, var prevalensen av KRAS-mutasjoner i flytende biopsier 40,8 %, og disse mutasjonene hadde en negativ innvirkning på total overlevelse med en HR på 3,16 [19]. Ulike ctDNA-deteksjonsmetoder har blitt brukt, men den nylige introduksjonen av digital dråpe-PCR (ddPCR), en ny robust PCR-metode for å kvantifisere punktmutasjoner med lav overflod i cellefritt sirkulerende DNA, viser lovende resultater og gir økt sensitivitet og reproduserbarhet i forhold til kvantitativ PCR (qPCR) [22]. Denne høysensitivitetsmetoden for ctDNA-deteksjon er klinisk og analytisk testet i en fersk studie som også bekrefter løftet om ctDNA som en klinisk nyttig prognostisk biomarkør i prøver før kirurgi, i umiddelbar postoperativ periode og i postoperativ oppfølging [ 23]. Forhåpentligvis, ved å bruke denne sensitive deteksjonsmetoden sammen med muligheten for flere vurderinger over tid, kan bruken av ctDNA være i stand til å forutsi behandlingsrespons og resistensmønstre tidligere, noe som fører til virkelig personlig medisin, med molekylærstyrte behandlingsbeslutninger basert på ett enkelt blod tegne [20].

Som ved påvisning av frie intraperitoneale maligne celler, har data om konsekvensene av sirkulerende tumor-DNA så langt ikke hatt vesentlige konsekvenser for anbefalingene og retningslinjene for behandling av PC-pasienter.

2.3 Hvorfor studere verdien av PLF-analyse hos PC-pasienter nå I løpet av de siste tiårene har nytten av forskjellige molekylære biomarkører for påvisning av tumorceller i PLF og blod vært gjenstand for interesse. Mange studier, inkludert nyere oversikter og metaanalyser, har bevist påvisning av KRAS-mutasjon i plasma som en prediktiv og prognostisk biomarkør samt en monitor av behandlingsrespons [17, 19-21, 24-27]. Dessuten har introduksjonen av ddPCR-metoden med høy presisjon ytterligere økt forventningene til nytten av KRAS-mutasjonsanalyse i plasma som en prognostisk biomarkør [18, 23, 28]. De siste årene har også studier som undersøker anvendeligheten av biomarkører i PLF gitt lovende resultater. Følsomheten ved bruk av PCR for påvisning av CEA er overlegen konvensjonell cytologi [4], spesielt når det kombineres med analyse av EpCAM [5]. Overraskende nok er det kun utført noen få, nesten historiske studier av KRAS mutasjonsanalyse i PLF [18-20]. Imidlertid fører de lovende resultatene og de åpenbare fordelene med ddPCR-analyse av KRAS i plasma i PC til det uunngåelige spørsmålet om KRAS-mutasjonsanalyse er mulig og egnet som en prognostisk biomarkør i PLF også.

Behandlingen av resektabel, lokalt avansert og metastatisk PC har endret seg betydelig de siste årene. Nye kjemoterapiregimer har forbedret overlevelsen ved metastatisk PC [29], og disse regimene (+/- strålebehandling) testes for tiden i både resektabel og lokalt avansert PC med lovende foreløpige resultater [30]. I teorien kan disse nye regimene være potensielt effektive mot ctDNA hos PC-pasienter, mens effekten på peritoneal lavage positive (PLF+) PC-pasienter er mer spekulativ på grunn av de lave intraperitoneale konsentrasjonene av systemisk kjemoterapi. Det siste problemet kan imidlertid løses ved å bruke trykksatt intraperitoneal aerosolkjemoterapi (PIPAC) som tillater bedre intraperitoneal distribusjon, konsentrasjon og akkumulering av kjemoterapi, uten de systemiske bivirkningene. Innledende erfaring med PIPAC har vist opptil 70 % histologiske responsrater ved manifeste peritoneale metastaser [31], PIPAC kan konvertere pasienter fra PLF+ til en PLF-status [32], og søkerens forskningsgruppe var den første i verden som viste effekt av PIPAC-rettet behandling hos PC-pasienter med manifeste peritoneale metastaser [2]. Gitt disse potensielle nye behandlingsalternativene mot okkulte kreftceller hos PC-pasienter, er tiden inne for å vurdere omfanget av problemet [4] med det endelige målet om å forbedre behandlingsstrategier og -resultater. Hvis den nåværende studien identifiserer en signifikant prognostisk faktor som kan diagnostiseres gjennom PLF, vil det neste trinnet være å bruke PIPAC-rettet adjuvant behandling hos disse pasientene. Faktisk pågår det for tiden en prospektiv studie på pasienter med høy risiko for tykktarmskreft, hvor disse pasientene behandles med PIPAC-rettet adjuvant terapi for å redusere risikoen for å utvikle peritoneale metastaser [5, 33]. PCR for mRNA var overlegen konvensjonell cytologi med immuncytokjemi [5]. Det kan imidlertid spekuleres i at den svært sensitive ddPCR av KRAS kan være et bedre verktøy for PLF+-deteksjon når man fokuserer på PC-pasienter, da opptil 95 % av disse har mutasjoner i dette genet.

3. Mål

1. Etterforskere tar sikte på å undersøke forekomsten av PLF+ og KRAS ctDNA i blodet fra en uselektert gruppe PC-pasienter som er planlagt for forsøk på kurativ kirurgi.
2. For det andre vil etterforskere studere den prognostiske effekten av PLF+ og KRAS ctDNA-positivitet hos PC-pasienter.

4. Materialer og metoder 4.1 Studiedesign og studiegruppe Prospektiv og beskrivende multisenterstudie som undersøker forekomsten av maligne celler og sirkulerende tumor-DNA i bukhinnen og av sirkulerende tumor-DNA i blodet før og etter tiltenkt kurativ reseksjon av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen . Omtrent 200 pasienter med PC reseksjoneres hvert år i Danmark, og 50 (25 %) av dem resereres ved Odense Universitetssykehus (OUH) (www.dpcg.dk). Basert på en nasjonal tilnærming og inkludering av 1-2 internasjonale høyvolumsentre (f.eks. Karolinska Universitetssykehuset (Sverige) og Lübeck Universitetssykehus (Tyskland)) og 2-3 store internasjonale sentre (f.eks. Halle (Saale (Tyskland)), kan minst 200 PC-pasienter rekrutteres for deltakelse innen ett år. Pasienter som er planlagt for tiltenkt kurativ reseksjon av PC er kvalifisert for inkludering. Pasienter med en annen postoperativ histologisk diagnose enn pankreasadenokarsinom og pasienter som kun har eksplorativ laparotomi/laparoskopi vil bli ekskludert. Det endelige målet er inkludering av 200 påfølgende pasienter. Antall inkluderte pasienter kan imidlertid tilpasses dersom flere data om prevalens av PLF+ i kirurgisk behandlet PC dukker opp.

Undersøkere vil samle blodprøver på 4 forskjellige tidspunkter og peritoneal lavage væske (PLF) under preoperativ (PL-1) og postoperativ (PL-2) diagnostisk laparoskopi. Konvensjonell cytologi med immuncytokjemi og ctDNA (KRAS)-analyser vil også bli utført i en negativ kontrollgruppe (godartet inflammatorisk ascites fra pasienter med dekompensert levercirrhose, n=20-30) og i en positiv kontrollgruppe (malign ascites eller PLF-prøver fra pasienter) med peritoneal metastase fra PC, derav pasienter som er kandidater for eller allerede mottar PIPAC-behandling, n=20-30). For valideringsformål vil også ddPCR for KRAS i blodet bli utført på en positiv kontrollgruppe bestående av pasienter med metastatisk PC (n=20) og på en negativ kontrollgruppe bestående av friske donorer (n=20).

4.2 Pasientregistrering Pasienter med PC blir evaluert på den lokale multidisiplinære (MDT) konferansen. Etter MDT-konferansen blir kandidater screenet for potensiell inkludering. Demografiske data, tidligere behandling og komorbiditet vil bli undersøkt i pasientmappe for å se om pasientene oppfyller inklusjonskriteriene. Etter screening informeres potensielle pasienter og - etter pasientforespørsel - pårørende individuelt av en kirurg som utfører inngrepet i rolige omgivelser uten forstyrrelser. Det vil bli gitt både muntlig og skriftlig informasjon, og etter en uke - etter tillatelse fra pasient - kontaktes kandidatene på telefon. Dersom deltakerne godtar, er både muntlig og skriftlig samtykke obligatorisk og vil innhentes under konsultasjon. Kandidater oppfordres til å ta med pårørende til dette møtet. Muntlig informasjon kan gis per telefon, men kun dersom den potensielle deltakeren har samtykket til dette kontaktskjemaet.

For å sikre optimal utvelgelse og behandling av pasientene som inngår i studien, må etterforskerne ha tilgang til journaler. Følgende demografiske og prosedyrerelaterte data vil bli lagret i en REDCap elektronisk CRF, levert og sikret av OPEN (Open Patient data Explorative Network): alder, kjønn, inklusjonskriterier, informert samtykke, ytelsesstatus, komorbiditet, dag og klokkeslett for operasjon, mulige bivirkninger og komplikasjoner, data vedrørende onkologisk behandling, data fra analyse av PLF, blod og vev og resultater av laparoskopisk undersøkelse og CT. Pasienter blir derfor screenet for potensiell inkludering under MDT, men informasjonen ovenfor vil først samles inn og registreres etter inkludering av pasientene.

4.3 Peritoneal lavage

1. De inkluderte deltakerne vil gjennomgå diagnostisk laparoskopi med LUS (LAP/LUS) i generell anestesi umiddelbart før reseksjon. Dette er en standard prosedyre hos alle PC-pasienter før reseksjon. Under laparoskopi utføres peritoneal lavage (PL) med 500 ml isotonisk saltvann, og minst 200 ml samles inn for analyser.
2. Etter reseksjon gjennomgår prøvene som inneholder primærtumoren patologisk undersøkelse og alle pasienter med N+ sykdom (kreft i en eller flere regionale lymfeknuter = høyrisikopasienter) tilbys oppfølging med CT etter 6-9 måneder. Ved residiv vil pasienter gå på ny MDT-konferanse for å fastsette behandling etter nasjonale retningslinjer, mens diagnostisk LAP/LUS med PL vil gjentas hos pasienter uten tegn til residiv (PL-2). Dersom den diagnostiske laparoskopien og/eller PLF-analysen viser tegn på peritoneale metastaser, vil pasienten bli henvist til en tverrfaglig konferanse i henhold til nasjonale retningslinjer. Dersom det ikke er tegn til metastaser vil pasienten gå over til standard oppfølging.
3. PLF vil bli behandlet på følgende måte: Hvis det er et spontant koagulum, vil det bli fiksert i formalin og innstøpt i parafin (FFPE). Fire sentrifugerør fylles med 50 ml av væsken og sentrifugeres. Fra sedimentet til det første røret vil det produseres to utstryk, tørket og farget med Papanicolaou og May-Giemsa Grünwald. Fra sedimentet til det andre røret vil en celleblokk fremstilles etter tilsetning av tre dråper plasma og to dråper trombin. Celleblokken vil være FFPE. Fra hver av de to FFPE-blokkene vil en 4-5 µm tykk seksjon kuttes med en mikrotom og farges med H&E for mikroskopisk analyse. Hvis det er hensiktsmessig, som bedømt av patologen og basert på funnene ved konvensjonell cytologi, vil seksjoner fra det parafininnstøpte materialet bli brukt til immuncytokjemiske analyser for PC-tumormarkører, som karsinoembryonalt antigen (CEA), EpCAM, IMP3, MUC5AC, S100P og /eller maspin samt markører for mesotelceller, som calretinin og vimentin, på 4 μm tykke snitt fra parafinblokken(e), som beskrevet tidligere [5]. Sedimentene til det tredje og fjerde røret vil bli lagret ved -80 °C i MagNA Pure LC Lysis Buffer (Roche), for påfølgende analyse ved hjelp av ddPCR. Fra det frosne sedimentet til det tredje og fjerde røret vil DNA bli isolert og undersøkt med ddPCR for KRAS-mutasjonen. Primere er designet for å målrette mutasjoner i kodon 12 og 13 alene (G12D, G12V, G12R og G13D), siden disse mønstrene står for 90 % av alle KRAS-mutasjoner [28].

4.4 Flytende biopsier Blodprøver tas etter diagnose, men før neoadjuvant terapi (når gitt) (BS-1), etter neoadjuvant terapi før kirurgi (BS-2), ca. en måned postoperativt og før adjuvant terapi (BS-3) ) og etter adjuvant terapi (når gitt) (BS-4). Ved hvert tidspunkt samles 20 ml (2 x 10 ml) perifert blod i etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) vacutainere. BS 1-4 analyseres som følger: DNA vil bli renset fra blodprøver (BS-1 - BS-4). Påvisning av KRAS-mutasjonen vil bli utført som beskrevet ovenfor.

4.5 Primærsvulst En formalinfiksert og parafininnstøpt (FFPE) eller frossen tumorblokk fra de inkluderte pasientene og fra de positive BS- og PLF-kontrollene (hvis tilgjengelig - ellers vil en FFPE-blokk med metastastisk vev) bli valgt av en patolog for DNA rensing for å utføre dd-PCR for KRAS og/eller neste generasjons sekvensering (NGS) for KRAS og andre relativt hyppig muterte gener (f. BRAF, p53, SMAD4, CTNNB1). Mengden analysert vev er ca. 5 mg (tilsvarende 3 x 10 μm parafinsnitt) og fra dette vevet vil det renses rundt 50 ng DNA for NGS-analyser. Dessuten vil histologisk tumortype og -grad samt TNM-status bli registrert. I dette prosjektet er tilnærmingen således målrettet sekvensering for et utvalgt antall muterte gener, og derfor brukes metoder som ikke er omfattende kartlegging av genomet. Hos KRASwt-pasienter vil PLF og BS bli analysert ved bruk av dd-PCR for en annen drivermutasjon enn KRAS, identifisert av NGS.

4.6 Pasientsikkerhet Diagnostisk laparoskopi med ultralyd (LAP/LUS) er en sikker prosedyre. Målet med LAP/LUS er å oppdage tegn på metastatisk sykdom (f. levermets, peritoneal mets) før åpen utforskning. Oppsamling av væske under denne laparoskopien er en enkel og sikker prosedyre, som lett kan utføres av enhver institusjon. Både LAP/LUS og postoperativ diagnostisk laparoskopi (se ovenfor) utføres imidlertid kun av erfarne laparoskopiske kirurger og risikoen for komplikasjoner er lav (<2 %, blødning, abscess, perforasjon). Den laparoskopiske undersøkelsen utføres under en kortvarig generell anestesi, som for noen kan gi kvalme, oppkast, hodepine, tretthet, svimmelhet, feber eller sår hals. Alvorlige bivirkninger er imidlertid svært sjeldne og vil oftest være forårsaket av inngrepet og pasientenes komorbide medisinske tilstand fremfor selve anestesimidlet. Eksempler på alvorlige bivirkninger er hjerteinfarkt (opptil 5%), lungeemboli (<2%), aspirasjon (0,03%), ondartet hypertermi (0,03%), anafylaksi (0,01%) og død (0,001%) [34] . En liten andel av pasientene vil også bli tilbudt en kontroll-CT-skanning, som er forbundet med en strålingseksponering tilsvarende ca. 3 års bakgrunnsstråling (cancer.dk). Imidlertid vil de fleste av pasientene som blir operert for kreft i bukspyttkjertelen få denne skanningen utført på et tidspunkt i oppfølgingsperioden. Det vil bli utført grundig preoperativ vurdering for å identifisere risikofaktorer og stratifisere pasienter slik at optimalisering og planlegging kan skje preoperativt. Blodprøvetaking er også en enkel prosedyre med svært liten risiko for ikke-alvorlige komplikasjoner som infeksjon og overfladisk hematom på innstikksstedet. Risikoen for disse bivirkningene minimeres ved desinfeksjon før innføring med alkoholbytte og kort kompresjon etter innføring over innføringsstedet.

Det er standard klinisk praksis å utføre LAP/LUS hos pasienter diagnostisert med PC umiddelbart før reseksjon. Imidlertid er PL og den påfølgende behandlingen av PLF ikke standard klinisk prosedyre hos disse pasientene. Også den andre LAP/LUS med PL-2, som tilbys kun en liten del av pasientene, og de 4 blodprøvene for KRAS-mutasjonsanalyse avviker fra standard klinisk praksis. Utførelse av NGS på FFPE fra primærtumor er ikke standard prosedyre, men vil ikke påvirke pasientens diagnose eller behandling. Alle andre aspekter ved denne studien er i samsvar med standard klinisk praksis (National clinical guidelines) og skiller seg derfor ikke mellom pasienter inkludert i denne studien og alle andre pasienter med PC.

4.7 Utfall Primære utfall • Frekvensen av pre- og postoperativ Cy +/- og/eller ctDNA (KRAS-mutasjon) +/- i PLF hos pasienter som gjennomgår tiltenkt kurativ reseksjon for PC

• Frekvensen av ctDNA (KRAS) +/- i blodprøver oppnådd hos pasienter som gjennomgår tiltenkt kurativ reseksjon for PC

Sekundære utfall • Total overlevelse, median overlevelse og residivfri overlevelse (RFS) i Cy+ versus Cy- og/eller ctDNA+ versus ctDNA- i PLFer

• Total overlevelse, median overlevelse og residivfri overlevelse (RFS) hos ctDNA+ versus ctDNA-pasienter

5. Statistikk Beskrivende statistikk vil bli brukt for å beskrive de inkluderte pasientene og frekvensen av Cy+ og ctDNA+. Overlevelse estimeres med Kaplan-Meier-metoden og log-rank-testen brukes til å sammenligne overlevelseskurver. For alle tester regnes p<0,05 som statistisk signifikant.

Beregning av prøvestørrelse Den rapporterte frekvensen av PLF+ varierer, sannsynligvis hovedsakelig på grunn av forskjellige metoder for å oppnå og analysere PL og forskjellige pasientkarakteristikker, men de samlede frekvensene av okkulte peritoneale tumorceller er 8 % (2-24 %) før og 33 % (15 -58%) etter manipulasjon (dvs. kirurgi) [4]. Litteraturen antyder at minst en tredjedel av pasienter med resektabel PC vil ha ctDNA (KRAS-mutasjoner) på tidspunktet for diagnosen [18]. Siden hovedendepunktene er beskrivende kan det ikke lages utvalgsstørrelser for disse.

PLF+ resekerte pasienter har en rapportert hazard ratio på 3,2 for total overlevelse, men med et veldig bredt konfidensintervall (1,9-5,4) [12]. For sykdomsfri overlevelse rapporteres en hazard ratio på 2,9 (2,4-3,5). Gitt usikkerheten angående både hazard ratio og frekvens av PLF+ ble en prøvestørrelse beregnet ved å bruke den laveste verdien av konfidensintervallet for OS hazard ratio (1,9) og en frekvens på PLF+ på 8 %. Med en styrke på 0,8 og alfa på 0,05 trengs totalt 161 pasienter (149 PLF- og 12 PLF+) for å oppdage et fareforhold på 1,9 mellom de to gruppene. Gitt usikkerheten til begge estimatene ble kraften estimert for tre forskjellige proporsjoner av PLF+ og to forskjellige HR for de tre forskjellige prøvestørrelsene.

Med en forventet frafallsrate på 10 % må totalt 180 pasienter inkluderes i studien, men på grunn av multisenteroppsettet er det endelige målet å inkludere 200 påfølgende pasienter.

6. Økonomi Delfinansiering av dette prosjektet er innhentet fra Kræftens Bekæmpelse (tildelingsbevilgning 2019-20: 342.900) DKK, Sagsnr. R218-A13057-18-S66), Forskningsrådet ("Forskningsrådet"), Odense Universitetssykehus (Tildelingsbevilgning 2019: 296.000 DKK, Sagsnr. A3064) og Axel Muusfeldts Fond (300.000 DKK, sagsnr. 2020-0172). Begge tilskuddene er tildelingstilskudd som skal dekke analyser av flytende biopsier og PL-væsker.

Etterforskere er nå i ferd med å søke om ytterligere midler. Ingen medlemmer av forskerteamet har økonomiske interesser i denne studien. Det er ingen relasjoner til noen donasjonsmidler.

7. Etikk Innsamling av PLF- og PB-materiale er en enkel og sikker prosedyre som enkelt kan utføres ved institusjonene som utfører PC-kirurgi; Derfor vil denne studien ikke utsette pasientene for noen risiko eller belastning utover den allerede kjente lave risikoen ved denne prosedyren. Noen av pasientene med N+ sykdom vil gjennomgå en ekstra laparoskopi med peritoneal lavage (PL-2), men risikoen for denne andre prosedyren er ikke signifikant forskjellig fra den første prosedyren før reseksjon. Den andre laparoskopien kan også være en fordel for disse høyrisikopasientene, siden den kan tillate tidlig oppdagelse av lokalt (peritonealt) og asymptomatisk residiv og dermed gi dem en raskere tilgang til relevant behandling.

Ettersom alle analyser av PB og PLF, med unntak av analysen av PLF-2, vil bli utført ved slutten av studieperioden, vil det opprettes en forskningsbiobank for dette prosjektet. På slutten av dette prosjektet vil rester av det lagrede materialet bli ødelagt.

Dessverre er det å forvente at mange (de fleste) pasienter vil vise seg å ha dødd av sykdommen. Vi søker derfor Etikkutvalget om unntak fra regelen om at det skal foreligge informert samtykke fra pasientene. Vi skal sørge for at pasienter ikke har tatt til orde for bruk av vevsprøver i Vævsanvendelsesregisteret. En andel positive PLF-kontroller har kun signert den opprinnelige samtykkeerklæringen om tillatelse til å utføre molekylære analyser på PLF, uten spesifikt samtykke til å utføre målrettet NGS for rundt 20 kreftrelaterte gener på arkivert histologisk materiale (fra primærtumor eller metastaser). Dette er imidlertid nødvendig for å kunne identifisere KRAS wt-pasienter, hvis PLF og PB vil bli analysert med dd-PCR for en annen drivermutasjon enn KRAS. Noen få av disse pasientene er døde eller har blitt avsluttet fra kirurgisk avdeling på grunn av sykdomsprogresjon. For disse pasientene søker vi dispensasjon fra å innhente tilleggssamtykke til å utføre målrettet NGS for rundt 20 kreftrelaterte gener også på materiale fra primærtumor eller en metastase.