Flydende biopsi for ctDNA i peritoneal lavage og blod i bugspytkirtelkræft (LIPAC)

1. Indledning Ca. 1.000 nye tilfælde af bugspytkirtelkræft (PC) diagnosticeres hvert år i Danmark. Duktalt adenokarcinom er langt den hyppigste histologiske undertype af kræft i bugspytkirtlen og tegner sig for mere end 90% af alle tilfælde [1]. I denne protokol refererer udtrykket PC således til pancreas duktalt adenokarcinom. PC er en ødelæggende sygdom med en samlet 5-års overlevelse på 3-7 % [2]. Mindre end hver fjerde patient er kandidat til påtænkt kurativ resektion, men selv efter mikroskopisk radikal resektion (R0-resektion) vil størstedelen af ​​patienterne have tilbagevendende sygdom inden for 2 år [3]. Uoverensstemmelsen mellem patologisk vurdering og klinisk resultat indikerer, at de fleste patienter vil huse ikke-opdagede (dvs. okkulte) kræftceller på tidspunktet for resektion.

   Det er af yderste vigtighed at forbedre vores evne til prognosticering og forudsigelse af PC, med henblik på en skræddersyet og personlig tilgang til behandlingsbeslutninger vedrørende denne aggressive type kræft. Dette projekt har til formål at tage et vigtigt skridt i denne retning ved en 2-trins tilgang: 1) Undersøgelse af det perifere blod (påvisning af cirkulerende tumor-DNA), og 2) den peritoneale lavagevæske (påvisning af tumor-DNA i peritonealrummet) ).

2. Baggrund PC er en dødelig sygdom, og kirurgisk resektion af tumoren er det eneste håb om helbredelse. Cirka 20-25 % af PC-patienterne er kandidater til påtænkt kurativ resektion på diagnosetidspunktet, men trods mikroskopisk radikal resektion vil størstedelen af ​​patienterne have recidiverende sygdom inden for 2 år [3]. Dette indikerer, at de fleste patienter vil rumme ikke-opdagede (dvs. okkulte) kræftceller på tidspunktet for resektion. Undersøgelser tyder på, at frie tumorceller i bughinden og i blodet er en del af denne okkulte sygdomsbyrde, og at patienter med sådanne fund ikke bør opereres, men behandles som havende metastatisk sygdom. Imidlertid er den nøjagtige forekomst af disse tumorceller i en ikke-selekteret kohorte af patienter, der gennemgår bugspytkirtelresektion, ukendt, og den potentielle indvirkning på postoperativ overlevelse er også usikker. I de senere år er molekylære biomarkører i stigende grad blevet betragtet som både prædiktive og prognostiske værktøjer for kræftpatienter. Denne undersøgelse vil bruge de mest optimale tilgængelige metoder til at undersøge forekomsten af ​​tumorceller i bughinden og blod hos PC-patienter, og til at relatere disse fund til det endelige resultat af de resekerede patienter. Dette projekt er blevet yderst relevant siden nye behandlingsmetoder (dvs. Tryksat IntraPeritoneal Aerosol Kemoterapi (PIPAC)) kan bruges til at udrydde frie tumorceller.

2.1 Positiv peritoneal lavage indikerer en dårlig prognose hos PC-patienter Okkulte maligne celler kan påvises i væske opnået ved peritoneal lavage (PLF) under stadieinddeling af laparoskopi, åben kirurgi eller udtaget fra postoperativ drænvæske hos patienter med PC. De ondartede celler diagnosticeres ved konventionel cytologi kombineret med immunocytologi, men real-time polymerasekædereaktion (RT-PCR) af CEA kan øge detektionshastigheden af ​​okkulte maligne celler i peritoneal skyllevæske [4]. Størstedelen af ​​datarapporter om brugen af ​​CEA [4], men også evaluering af EpCAM har været genstand for interesse. En nylig undersøgelse rapporterede kombinationen af ​​CEA/EpCAM mRNA som et optimeret set-up til påvisning af frie intraperitoneale tumorceller af forskellig oprindelse med en høj sensitivitet og en fremragende specificitet [5]. En anden markør, CA 19-9, har vundet interesse, dog mest i undersøgelser, der inkluderer mavekræftpatienter og præsenterer resultaterne i proteinniveauer i stedet for mRNA. Disse undersøgelser tyder på, at forhøjede niveauer af CA 19-9 i PL er forbundet med mere fremskredne sygdomsstadier, er en mere pålidelig forudsigende faktor for stadieinddeling end serum CA 19-9 niveauer og er en mere følsom markør end CEA [6, 7] .

Mens mRNA- og proteinbaserede analyser har vist lovende resultater, eksisterer der kun kasuistiske data om påvisning af KRAS-mutationer i PLF [8-10]. I en norsk undersøgelse, der omfattede patienter resekeret for endetarmskræft, blev der imidlertid fundet KRAS-mutationer i PLF indsamlet umiddelbart efter operationen hos 19 ud af 237 patienter. Disse KRAS-positive patienter havde signifikant dårligere overlevelse [11], og lignende resultater kan også findes hos patienter resekeret til PC.

En nylig systematisk gennemgang og meta-analyse viste, at PC-patienter med positiv peritoneal cytologi (Cy+) havde en signifikant dårligere overlevelse end patienter med negativ peritonealcytologi (Cy-)(HR 3.18), og forfatterne konkluderede, at Cy+-patienter ikke skulle opereres. [12]. Denne konklusion blev understøttet af en signifikant lavere samlet overlevelse og en højere peritoneal recidivrate efter resektion af Cy+-patienter sammenlignet med Cy-patienter [13]. Enighed om, at Cy+ i resektabel PDAC er en negativ prædiktor for prognose, kom fra en anden nylig metaanalyse og systematisk gennemgang. Imidlertid indikerede denne undersøgelse også, at median OS var værre hos patienter uden end hos dem med resektion blandt patienter med Cy+, hvilket understregede behovet for yderligere omhyggelig vurdering af indikationer for radikal resektion hos Cy+-patienter [14]. Derudover skal det bemærkes, at manipulation af tumor under operation signifikant øger frekvensen af ​​patienter med positiv PLF (baseret på EpCAM mRNA-målinger) fra 10 % til 54 %, selvom denne undersøgelse ikke var i stand til at påvise en dårligere prognose hos EpCAM positive patienter [ 3].

På trods af sådanne beviser inkluderer størstedelen af ​​internationale retningslinjer ikke peritoneal lavage og cytologi, proteinanalyse eller RT-PCR som en del af den præoperative evaluering af PC-patienter. Denne observation kan forklares med den retrospektive oprindelse af de fleste af disse (hovedsageligt japanske) data, mangel på ensartethed med hensyn til definition af metoder, der anvendes til analyse af PLF, mangel på undersøgelser, der evaluerer præoperativ behandling af PLF+ patienter, og en generel modvilje mod at acceptere, at flertallet af resektable PC-patienter har spredt sygdom på diagnosetidspunktet.

2.2 Cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) i blodet er en markør for dårlig prognose hos PC-patienter Der er foretaget store forbedringer i forståelsen af ​​den molekylære carcinogenese og det genetiske landskab i PC. En væsentlig milepæl er afsløringen af ​​fire almindelige drivgener i pc-karcinogenese. KRAS er muteret i 90-95%, og er derfor det hyppigst muterede gen hos PC-patienter, efterfulgt af mindre hyppige mutationer i TP53 (50%), SMAD4 (19%) og CDKN2A/P16 (6%) [15, 16 ]. Interessant nok er KRAS-mutationer også blevet påvist i cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) i blodet (flydende biopsier) fra patienter med metastatisk PC, og ctDNA betragtes som en markør for dårlig prognose [17]. Tilsvarende blev KRAS-mutationer fundet i plasma fra en tredjedel af patienter med en resektabel tumor, og ctDNA-positive (ctDNA+) patienter havde en signifikant dårligere samlet overlevelse (13,6 måneder vs. 27,6 måneder, p<0,0001) [18]. Lignende konklusioner blev draget i nyere systematiske reviews og metaanalyser [19,20], mens en undersøgelse ikke kunne bekræfte disse resultater. Påvisningen af ​​KRAS-mutationer i cellefrit DNA er også blevet identificeret som en prognostisk biomarkør hos PC-patienter [21]. Desuden er kombinationen af ​​KRAS-mutationsanalyse og CA 19-9-assay nyttig til påvisning og prognostisk evaluering af pancreascarcinom. Hvis man ser på undersøgelser, der inkluderer alle stadier af PC-patienter, var prævalensen af ​​KRAS-mutationer i flydende biopsier 40,8 %, og disse mutationer havde en negativ indvirkning på den samlede overlevelse med en HR på 3,16 [19]. Forskellige ctDNA-detektionsmetoder er blevet brugt, men den nylige introduktion af digital dråbe-PCR (ddPCR), en ny robust PCR-metode til kvantificering af lav-abundance punktmutationer i cellefrit cirkulerende DNA, viser lovende resultater og giver øget følsomhed og reproducerbarhed ift. kvantitativ PCR (qPCR) [22]. Denne højfølsomhedsmetode til ctDNA-detektion er blevet klinisk og analytisk testet i en nylig undersøgelse, der også bekræfter løftet om ctDNA som en klinisk nyttig prognostisk biomarkør i præ-kirurgiske prøver, i umiddelbar post-operativ periode og i post-operativ opfølgning [ 23]. Forhåbentlig kan brugen af ​​ctDNA ved anvendelse af denne følsomme detektionsmetode sammen med muligheden for flere vurderinger over tid være i stand til at forudsige behandlingsrespons og resistensmønstre tidligere, hvilket fører til virkelig personlig medicin, med molekylær-guidede behandlingsbeslutninger baseret på et enkelt blod tegne [20].

Ligesom ved påvisning af frie intraperitoneale maligne celler har data om konsekvenserne af cirkulerende tumor-DNA hidtil ikke haft væsentlig betydning for anbefalinger og retningslinjer vedrørende behandling af PC-patienter.

2.3 Hvorfor studere værdien af ​​PLF-analyse hos PC-patienter nu I løbet af de sidste årtier har brugen af ​​forskellige molekylære biomarkører til påvisning af tumorceller i PLF og blod været genstand for interesse. Mange undersøgelser, herunder nylige anmeldelser og metaanalyser, har bevist påvisning af KRAS-mutation i plasma som en forudsigende og prognostisk biomarkør såvel som en monitor af behandlingsrespons [17, 19-21, 24-27]. Desuden har introduktionen af ​​højpræcisions-ddPCR-metoden yderligere øget forventningerne til nytten af ​​KRAS-mutationsanalyse i plasma som en prognostisk biomarkør [18, 23, 28]. I de senere år har også undersøgelser, der undersøger anvendeligheden af ​​biomarkører i PLF, givet lovende resultater. Følsomheden ved at bruge PCR til påvisning af CEA er overlegen i forhold til konventionel cytologi [4], især når det kombineres med analyse af EpCAM [5]. Overraskende nok er der kun udført få, næsten historiske studier af KRAS mutationsanalyse i PLF [18-20]. De lovende resultater og de åbenlyse fordele ved ddPCR-analyse af KRAS i plasma i PC fører imidlertid til det uundgåelige spørgsmål, om KRAS-mutationsanalyse også er mulig og egnet som en prognostisk biomarkør i PLF.

Behandlingen af ​​resektabel, lokalt avanceret og metastatisk PC har ændret sig markant i løbet af de seneste år. Nye kemoterapiregimer har forbedret overlevelsen i metastatisk PC [29], og disse regimer (+/- strålebehandling) testes i øjeblikket i både resektabel og lokalt avanceret PC med lovende foreløbige resultater [30]. I teorien kan disse nye regimer være potentielt effektive mod ctDNA hos PC-patienter, hvorimod effekten på peritoneal lavage-positive (PLF+) PC-patienter er mere spekulativ på grund af de lave intraperitoneale koncentrationer af systemisk kemoterapi. Sidstnævnte problem kan dog løses ved at bruge Pressurized IntraPeritoneal Aerosol Chemotherapy (PIPAC), som tillader bedre intraperitoneal fordeling, koncentration og akkumulering af kemoterapi uden de systemiske bivirkninger. Indledende PIPAC-erfaringer har vist op til 70 % histologiske responsrater i manifeste peritoneale metastaser [31], PIPAC kan konvertere patienter fra PLF+ til en PLF-status [32], og ansøgerens forskningsgruppe var den første i verden, der viste en effekt af PIPAC-rettet behandling hos PC-patienter med manifeste peritoneale metastaser [2]. I betragtning af disse potentielle nye behandlingsmuligheder mod okkulte cancerceller hos PC-patienter, er tiden kommet til at vurdere omfanget af problemet [4] med det ultimative mål at forbedre behandlingsstrategier og -resultater. Så hvis den foreliggende undersøgelse identificerer en signifikant prognostisk faktor, der kan diagnosticeres gennem PLF, så ville det næste skridt være at bruge PIPAC-rettet adjuverende behandling til disse patienter. Faktisk er et prospektivt studie i højrisiko tyktarmskræftpatienter i gang, hvor disse patienter behandles med PIPAC-rettet adjuverende terapi for at reducere risikoen for udvikling af peritoneale metastaser [5, 33]. PCR for mRNA var overlegen i forhold til konventionel cytologi med immuncytokemi [5]. Det kan dog spekuleres i, at den meget følsomme ddPCR af KRAS kan være et bedre værktøj til PLF+-detektion, når man fokuserer på PC-patienter, da op til 95% af disse har mutationer i dette gen.

3. Mål

1. Efterforskere sigter mod at undersøge forekomsten af ​​PLF+ og KRAS ctDNA i blodet fra en ikke-udvalgt kohorte af PC-patienter, der er planlagt til forsøg på helbredende kirurgi.
2. For det andet vil efterforskere studere den prognostiske effekt af PLF+ og KRAS ctDNA positivitet hos PC-patienter.

4. Materialer og metoder 4.1 Undersøgelsesdesign og undersøgelsesgruppe Prospektiv og beskrivende multicenterundersøgelse, der undersøger forekomsten af ​​maligne celler og cirkulerende tumor-DNA i bughinden og af cirkulerende tumor-DNA i blodet før og efter påtænkt helbredende resektion af patienter med bugspytkirtelkræft . Cirka 200 patienter med PC resekeres hvert år i Danmark, og 50 (25%) af dem resekeres på Odense Universitetshospital (OUH) (www.dpcg.dk). Baseret på en national tilgang og inddragelse af 1-2 internationale højvolumencentre (f.eks. Karolinska Universitetshospitalet (Sverige) og Lübeck Universitetshospital (Tyskland)) og 2-3 store internationale centre (f.eks. Halle (Saale (Tyskland)), kan mindst 200 PC-patienter rekrutteres til deltagelse inden for et år. Patienter, der er planlagt til tilsigtet kurativ resektion af PC, er berettiget til inklusion. Patienter med en anden postoperativ histologisk diagnose end pancreas-adenokarcinom og patienter, der kun har eksplorativ laparotomi/laparoskopi, vil blive udelukket. Det ultimative mål er inklusion af 200 på hinanden følgende patienter. Antallet af inkluderede patienter kan dog tilpasses, hvis der fremkommer flere data om forekomsten af ​​PLF+ i kirurgisk behandlet PC.

Efterforskere vil indsamle blodprøver på 4 forskellige tidspunkter og peritoneal lavagevæske (PLF) under præoperativ (PL-1) og postoperativ (PL-2) diagnostisk laparoskopi. Konventionel cytologi med immuncytokemi og ctDNA (KRAS) analyser vil også blive udført i en negativ kontrolgruppe (godartet inflammatorisk ascites fra patienter med dekompenseret levercirrhose, n=20-30) og i en positiv kontrolgruppe (malign ascites eller PLF-prøver fra patienter med peritoneal metastase fra PC, derfor patienter, der er kandidater til eller allerede modtager PIPAC-behandling, n=20-30). Ligeledes vil ddPCR for KRAS i blodet med henblik på validering også blive udført på en positiv kontrolgruppe bestående af patienter med metastatisk PC (n=20) og på en negativ kontrolgruppe bestående af raske donorer (n=20).

4.2 Patientindskrivning Patienter med PC evalueres på den lokale multidisciplinære (MDT) konference. Efter MDT-konferencen screenes kandidater for potentiel inklusion. Demografiske data, tidligere behandling og komorbiditet vil blive undersøgt i patientjournalen for at se, om patienterne opfylder inklusionskriterierne. Efter screening informeres potentielle patienter og - efter patientens ønske - pårørende individuelt af en kirurg, der udfører indgrebet i rolige omgivelser uden forstyrrelser. Der vil blive givet både mundtlig og skriftlig information, og efter en uge - efter tilladelse fra patienten - kontaktes kandidaterne telefonisk. Hvis deltagerne accepterer, er både mundtligt og skriftligt samtykke obligatorisk og vil blive indhentet under konsultationen. Kandidater opfordres til at tage pårørende med til dette møde. Mundtlig information kan gives telefonisk, men kun hvis den potentielle deltager har accepteret denne kontaktformular.

For at sikre den optimale udvælgelse og behandling af de patienter, der indgår i undersøgelsen, skal efterforskerne have adgang til journaler. Følgende demografiske og procedurerelaterede data vil blive lagret i en REDCap elektronisk CRF, leveret og sikret af OPEN (Open Patient data Explorative Network): alder, køn, inklusionskriterier, informeret samtykke, præstationsstatus, komorbiditet, dag og tidspunkt for operation, mulige bivirkninger og komplikationer, data vedrørende onkologisk behandling, data fra analyse af PLF, blod og væv samt resultater af laparoskopisk undersøgelse og CT. Patienter screenes således for potentiel inklusion under MDT, men ovenstående information vil først blive indsamlet og registreret efter inklusion af patienterne.

4.3 Peritoneal lavage

1. De inkluderede deltagere vil gennemgå diagnostisk laparoskopi med LUS (LAP/LUS) i generel anæstesi umiddelbart før resektion. Dette er en standardprocedure hos alle PC-patienter før resektion. Ved laparoskopi udføres peritoneal lavage (PL) med 500 ml isotonisk saltvand, og der opsamles mindst 200 ml til analyser.
2. Efter resektion gennemgår prøverne indeholdende den primære tumor patologisk undersøgelse og alle patienter med N+ sygdom (kræft i en eller flere regionale lymfeknuder = højrisikopatienter) tilbydes opfølgning med CT efter 6-9 måneder. I tilfælde af recidiv vil patienter gå til en ny MDT-konference for at fastlægge behandling efter nationale retningslinjer, mens diagnostisk LAP/LUS med PL vil blive gentaget hos patienter uden tegn på recidiv (PL-2). Hvis den diagnostiske laparoskopi og/eller PLF-analyse viser tegn på peritoneale metastaser, vil patienten blive henvist til en multidisciplinær konference efter nationale retningslinjer. Hvis der ikke er tegn på metastaser, vil patienten skifte til standardopfølgning.
3. PLF vil blive behandlet som følger: Hvis et spontant koagulum er til stede, vil det blive fikseret i formalin og indlejret i paraffin (FFPE). Fire centrifugerør fyldes med 50 ml af væsken og centrifugeres. Fra sedimentet af det første rør vil der blive produceret to udstrygninger, tørret og farvet med Papanicolaou og May-Giemsa Grünwald. Fra sedimentet af det andet rør vil en celleblok blive fremstillet efter tilsætning af tre dråber plasma og to dråber trombin. Celleblokken vil være FFPE. Fra hver af de to FFPE-blokke vil en 4-5 µm tyk sektion blive skåret med en mikrotom og farvet med H&E til mikroskopisk analyse. Hvis det er relevant, som bedømt af patologen og baseret på fundene ved konventionel cytologi, vil snit fra det paraffinindlejrede materiale blive brugt til immuncytokemiske analyser for PC-tumormarkører, såsom carcinoembryonalt antigen (CEA), EpCAM, IMP3, MUC5AC, S100P og /eller maspin samt markører for mesothelceller, såsom calretinin og vimentin, på 4 μm tykke snit fra paraffinblokken(erne), som beskrevet tidligere [5]. Sedimenterne fra det tredje og fjerde rør vil blive opbevaret ved -80°C i MagNA Pure LC Lysis Buffer (Roche), til efterfølgende analyse med ddPCR. Fra det frosne sediment i det tredje og fjerde rør, vil DNA blive isoleret og undersøgt med ddPCR for KRAS-mutationen. Primere er designet til at målrette mutationer i kodon 12 og 13 alene (G12D, G12V, G12R og G13D), da disse mønstre tegner sig for 90% af alle KRAS-mutationer [28].

4.4 Flydende biopsier Blodprøver tages efter diagnose, men før neoadjuverende terapi (når givet) (BS-1), efter neoadjuverende terapi før operation (BS-2), ca. en måned postoperativt og før adjuverende terapi (BS-3) ) og efter adjuverende terapi (når givet) (BS-4). Ved hvert tidspunkt opsamles 20 ml (2 x 10 ml) perifert blod i ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) vacutainere. BS 1-4 analyseres som følger: DNA vil blive oprenset fra blodprøver (BS-1 - BS-4). Påvisning af KRAS-mutationen vil blive udført som beskrevet ovenfor.

4.5 Primær tumor Én formalinfikseret og paraffinindlejret (FFPE) eller frossen tumorblok fra de inkluderede patienter og fra de positive BS- og PLF-kontroller (hvis tilgængelig - ellers vil en FFPE-blok med metastastisk væv) blive udvalgt af en patolog for DNA oprensning for at udføre dd-PCR for KRAS og/eller næste generations sekventering (NGS) for KRAS og andre relativt hyppigt muterede gener (f.eks. BRAF, p53, SMAD4, CTNNB1). Mængden af ​​analyseret væv er ca. 5 mg (svarende til 3 x 10 μm paraffinsnit), og fra dette væv vil omkring 50 ng DNA blive oprenset til NGS-analyser. Desuden vil histologisk tumortype og -grad samt TNM-status blive registreret. I dette projekt er tilgangen således målrettet sekventering for et udvalgt antal muterede gener, og derfor anvendes metoder, som ikke er omfattende kortlægning af genomet. Hos KRASwt-patienter vil PLF og BS blive analyseret ved hjælp af dd-PCR for en anden drivermutation end KRAS, identificeret af NGS.

4.6 Patientsikkerhed Diagnostisk laparoskopi med ultralyd (LAP/LUS) er en sikker procedure. Målet med LAP/LUS er at opdage tegn på metastatisk sygdom (f. levermets, peritoneale mets) før åben udforskning. Opsamling af væske under denne laparoskopi er en enkel og sikker procedure, som let kan udføres af enhver institution. Både LAP/LUS og den postoperative diagnostiske laparoskopi (se ovenfor) udføres dog kun af erfarne laparoskopiske kirurger, og risikoen for komplikationer er lav (<2 %, blødning, byld, perforation). Den laparoskopiske undersøgelse foretages under en kortvarig generel anæstesi, som for nogle kan give kvalme, opkastning, hovedpine, træthed, svimmelhed, feber eller ømhed i halsen. Alvorlige bivirkninger er dog meget sjældne og vil oftest være forårsaget af indgrebet og patienternes komorbide sygdomstilstand frem for selve bedøvelsen. Eksempler på alvorlige bivirkninger er myokardieinfarkt (op til 5%), lungeemboli (<2%), aspiration (0,03%), malign hypertermi (0,03%), anafylaksi (0,01%) og død (0,001%) [34] . Ligeledes vil en mindre del af patienterne blive tilbudt en kontrol-CT-scanning, som er forbundet med en strålingseksponering svarende til ca. 3 års baggrundsstråling (cancer.dk). De fleste patienter, som bliver opereret for kræft i bugspytkirtlen, vil dog få foretaget denne scanning på et tidspunkt i opfølgningsperioden. Der vil blive udført grundig præoperativ vurdering med henblik på at identificere risikofaktorer og stratificere patienter, således at optimering og planlægning kan ske præoperativt. Blodprøvetagning er også en simpel procedure med en meget lille risiko for ikke-alvorlige komplikationer såsom infektion og overfladisk hæmatom på indføringsstedet. Risikoen for disse bivirkninger minimeres ved henholdsvis desinfektion før indsættelse med alkoholswaps og kort kompression efter indføring over indføringsstedet.

Det er standard klinisk praksis at udføre LAP/LUS hos patienter diagnosticeret med PC umiddelbart før resektion. Imidlertid er PL og den efterfølgende behandling af PLF ikke standard klinisk procedure hos disse patienter. Også den anden LAP/LUS med PL-2, som kun tilbydes til en lille del af patienterne, og de 4 blodprøver til KRAS-mutationsanalyse afviger fra standard klinisk praksis. Udførelsen af ​​NGS på FFPE fra primær tumor er ikke standardprocedure, men vil ikke påvirke patientens diagnose eller behandling. Alle andre aspekter af denne undersøgelse er i overensstemmelse med standard klinisk praksis (Nationale kliniske retningslinjer) og adskiller sig derfor ikke mellem patienter inkluderet i denne undersøgelse og alle andre patienter med PC.

4.7 Resultater Primære resultater • Hyppigheden af ​​præ- og postoperativ Cy +/- og/eller ctDNA (KRAS-mutation) +/- i PLF hos patienter, der gennemgår tilsigtet helbredende resektion for PC

• Raten af ​​ctDNA (KRAS) +/- i blodprøver opnået hos patienter, der gennemgår tilsigtet helbredende resektion til PC

Sekundære resultater • Samlet overlevelse, median overlevelse og recidivfri overlevelse (RFS) i Cy+ versus Cy- og/eller ctDNA+ versus ctDNA- i PLF'er

• Samlet overlevelse, median overlevelse og recidivfri overlevelse (RFS) hos ctDNA+ versus ctDNA-patienter

5. Statistik Beskrivende statistik vil blive brugt til at beskrive de inkluderede patienter og frekvensen af ​​Cy+ og ctDNA+. Overlevelse estimeres med Kaplan-Meier metoden, og log-rank testen bruges til at sammenligne overlevelseskurver. For alle test anses p<0,05 for statistisk signifikant.

Prøvestørrelsesberegning Den rapporterede frekvens af PLF+ varierer, sandsynligvis hovedsageligt på grund af forskellige metoder til at opnå og analysere PL og forskellige patientkarakteristika, men de samlede rater af okkulte peritoneale tumorceller er 8 % (2-24 %) før og 33 % (15) -58%) efter manipulation (dvs. kirurgi) [4]. Litteraturen tyder på, at mindst en tredjedel af patienter med resecerbar PC vil have ctDNA (KRAS-mutationer) på tidspunktet for diagnosen [18]. Da hovedendepunkterne er beskrivende, kan der ikke laves prøvestørrelser for disse.

PLF+ resekerede patienter har et rapporteret hazard ratio på 3,2 for samlet overlevelse, men med et meget bredt konfidensinterval (1,9-5,4) [12]. For sygdomsfri overlevelse rapporteres et hazard ratio på 2,9 (2,4-3,5). På baggrund af usikkerheden med hensyn til både hazard ratio og frekvens af PLF+ blev en stikprøvestørrelse beregnet ud fra den laveste værdi af konfidensintervallet for OS hazard ratio (1,9) og en frekvens på PLF+ på 8 %. Med en styrke på 0,8 og alfa på 0,05 er der behov for i alt 161 patienter (149 PLF- og 12 PLF+) for at detektere et hazard ratio på 1,9 mellem de to grupper. I betragtning af usikkerheden af ​​begge estimater blev effekten estimeret for tre forskellige proportioner af PLF+ og to forskellige HR for de tre forskellige stikprøvestørrelser.

Med en forventet frafaldsrate på 10 % skal i alt 180 patienter inkluderes i undersøgelsen, men på grund af multicenter-opsætningen er det endelige mål at inkludere 200 på hinanden følgende patienter.

6. Økonomi Delfinansiering af dette projekt er opnået fra Kræftens Bekæmpelse (Bevilling 2019-20: 342.900,- kr., Sagsnr. R218-A13057-18-S66), Forskningsrådet (Forskningsrådet), Odense Universitetshospital (Bevilling 2019: 296.000 kr., Sagsnr. A3064) og Axel Muusfeldts Fond (300.000 kr., sagsnr. 2020-0172). Begge bevillinger er tildelingsbevillinger, der skal dække analyser af flydende biopsier og PL-væsker.

Efterforskere er i øjeblikket i gang med at ansøge om yderligere midler. Ingen medlemmer af forskerholdet har økonomiske interesser i nærværende undersøgelse. Der er ingen relation til nogen donerende midler.

7. Etik Indsamlingen af ​​PLF- og PB-materiale er et enkelt og sikkert indgreb, der nemt kan udføres på de institutioner, der udfører PC-kirurgi; derfor vil denne undersøgelse ikke udsætte patienterne for nogen risici eller belastning udover den allerede kendte lave risiko ved denne procedure. Nogle af patienterne med N+ sygdom vil gennemgå en yderligere laparoskopi med peritoneal lavage (PL-2), men risikoen ved denne anden procedure er ikke signifikant forskellig fra den første procedure før resektion. Den anden laparoskopi kan også være en fordel for disse højrisikopatienter, da den kan muliggøre tidlig påvisning af lokalt (peritonealt) og asymptomatisk tilbagefald og dermed give dem en hurtigere adgang til relevant behandling.

Da alle analyser af PB og PLF, med undtagelse af analysen af ​​PLF-2, vil blive udført i slutningen af ​​undersøgelsesperioden, vil der blive etableret en forskningsbiobank for dette projekt. Ved afslutningen af ​​dette projekt vil rester af det opbevarede materiale blive destrueret.

Desværre må det forventes, at mange (de fleste) patienter vil vise sig at være døde af deres sygdom. Derfor anmoder vi Den Etiske Komité om en undtagelse fra reglen om, at der skal foreligge informeret samtykke fra patienterne. Vi vil sikre, at patienterne ikke har talt imod brugen af ​​vævsprøver i Vævsanvendelsesregisteret. En del af positive PLF-kontroller har kun underskrevet den oprindelige samtykkeerklæring vedrørende tilladelse til at udføre molekylære analyser på PLF, uden specifikt samtykke til at udføre målrettet NGS for omkring 20 cancerrelaterede gener på arkiveret histologisk materiale (fra primær tumor eller metastaser). Dette er dog nødvendigt for at kunne identificere KRAS wt-patienter, hvis PLF og PB vil blive analyseret med dd-PCR for en anden drivermutation end KRAS. Nogle få af disse patienter er døde eller er blevet afsluttet på kirurgisk afdeling på grund af sygdomsprogression. For disse patienter søger vi om dispensation fra at indhente et supplerende samtykke til at udføre målrettet NGS for omkring 20 kræftrelaterede gener også på materiale fra primær tumor eller en metastase.