Metoda Step Down u dzieci z alergią na mleko krowie (SDACMA)

Do badania zostanie zaproszonych 60 dzieci z CMA, w których pośredniczy immunoglobulina E, obserwowanych kolejno w ośrodkach alergii pokarmowych trzeciego stopnia, które spełnią kryteria włączenia. Dane anamnestyczne, demograficzne, antropometryczne i kliniczne, a także informacje o czynnikach społeczno-demograficznych, warunkach rodziny i życia, historii chorób alergicznych u rodziców, liczbie rodzeństwa i posiadaniu zwierząt domowych będą pozyskiwane od rodziców każdego niemowlęcia i rejestrowane w baza kliniczna.

Następnie u wszystkich badanych zostanie przeprowadzona prowokacja pokarmowa z EHCF + LGG. Tylko osoby z ujemnym wynikiem prowokacji pokarmowej zostaną losowo przydzielone do jednej z dwóch grup interwencji dietetycznych na 12-miesięczny okres obserwacji: grupa 1 otrzymała AAF, a grupa 2 otrzymała EHCF + LGG.

Skuteczność stosowania formuły zostanie oceniona podczas badania przez dietetyków doradzających rodzicom w kwestiach, które mogą pojawić się podczas stosowania diety eliminacyjnej. Rodzice lub opiekunowie zostaną poproszeni o prowadzenie dziennego rejestru stosowania formuły. Przygotowana ilość (milimetry wody i liczba łyżek mleka modyfikowanego) oraz ilość pozostała po każdym spożyciu będzie zapisywana w dzienniczku, aby ocenić ilość spożytą przez dziecko.

Podczas rekrutacji, po 6 i 12 miesiącach wzrost ciała będzie oceniany na podstawie masy ciała, długości ciała i obwodu głowy mierzonych podczas rejestracji, po 6 i 12 miesiącach obserwacji w odniesieniu do wykresów wzrostu. W razie potrzeby realizowane będą wizyty nieplanowane.

Ponadto podczas rejestracji, po 6 i 12 miesiącach, badacze przeprowadzą:

1. Wszystkie procedury prowokacji pokarmem doustnym będą przeprowadzane w trybie podwójnie ślepej próby przez 2 kolejne dni. Pełen sprzęt ratunkowy i leki (adrenalina, leki przeciwhistaminowe, sterydy) będą pod ręką. Prowokacja zostanie przerwana po pojawieniu się objawów klinicznych lub po osiągnięciu najwyższej dawki. Dziecko będzie obserwowane przez 2 godziny, a następnie wypisane.
2. Punktowe testy skórne (mleko pełne, kazeina, α-laktoalbumina, β-laktoglobulina): alergeny i świeże mleko będą podawane pacjentom przedramię dłoniowe: mleko krowie (CM) zawierające 3,5% tłuszczu. Punktowe testy skórne przeprowadzono przy użyciu lancetu z pojedynczym szczytem 1 mm (ALK, Kopenhaga, Dania), z dichlorowodorkiem histaminy (10 mg/ml) i izotonicznym roztworem soli fizjologicznej (NaCl 0,9%) jako odpowiednio kontrolą pozytywną i negatywną. Reakcje będą rejestrowane na podstawie największej średnicy (w milimetrach) bąbla i zaczerwienienia po 15 minutach. Wynik SPT zostanie uznany za „pozytywny”, jeśli bąbel miał 3 mm lub więcej, bez reakcji kontroli ujemnej.
3. IgE całkowite i IgE swoiste oraz Immunoglobulina G 4 przeciwko białkom i epitopom mleka krowiego: wykonamy pobranie krwi żylnej; Surowica pacjentów zostanie pobrana za pomocą probówek do separacji surowicy i została uzyskana przez wirowanie przez 10-15 minut. Surowica zostanie błyskawicznie zamrożona i przechowywana w temperaturze -80°C do czasu dalszej analizy. Z surowicy zostanie przebadane immunoenzymatycznym oznaczeniem IgE całkowite oraz swoiste IgE i IgG4 przeciwko białkom i epitopom mleka krowiego.
4. Skład mikroflory jelitowej: zostanie pobrana próbka kału, natychmiast zamrożona do -80°C i przechowywana do dalszej analizy. Całkowity genomowy DNA (gDNA) zostanie wyizolowany z materiału kałowego przy użyciu określonego DNA. Zestaw do izolacji i skład mikroflory jelitowej zostaną przeanalizowane przy użyciu podejścia opartego na bakteriach i sekwencjonowaniu wewnętrznego transkrybowanego regionu rozdzielającego (sekwencjonowanie wysokowydajne).
5. Produkcja kału i surowicy z krótkołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi (SCFA): zostanie pobrana próbka kału i surowica. Jeden gram próbek kału zostanie zważony, rozcieńczony w stosunku 1:2 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i zhomogenizowany. Supernatanty zostaną następnie uzyskane przez odwirowanie (10 000 g, 30 minut, 4°C), przesączenie przez filtry 0,2 μm i przechowywanie w temperaturze -80°C do czasu analizy. Surowica pacjentów zostanie pobrana za pomocą probówek z separatorem surowicy i została uzyskana przez wirowanie przez 10-15 minut. Surowica zostanie błyskawicznie zamrożona i przechowywana w temperaturze -80°C do czasu dalszej analizy. Analiza SCFA zostanie przeprowadzona przy użyciu chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (MS) w celu pomiaru stężeń kwasu octowego, propionowego i masłowego w próbkach kału.
6. Stężenie interleukiny (IL)-4, IL-5, IL-13, IL-10, interferonu (IFN)-γ w surowicy krwi: wykonamy pobranie krwi żylnej; Surowica pacjentów zostanie pobrana za pomocą probówek do separacji surowicy i została uzyskana przez wirowanie przez 10-15 minut. Surowica zostanie szybko zamrożona i przechowywana w temperaturze -80°C. Z surowicy zostaną oznaczone IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IFN-γ za pomocą testu ELISA (specyficzny zestaw dla każdej cytokiny).
7. Status metylacji regionu promotora genów zaangażowanych w alergię IgE-zależną, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 i IFN-γ oraz FoxP3+: Od pacjentów zostanie pobrana krew żylna, a DNA zostanie ekstrahowano z leukocytów przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA. Wyekstrahowane DNA zostanie zmodyfikowane wodorosiarczynem sodu przy użyciu zestawu Methylation Gold Kit (ZYMO Research Co.) zgodnie z zaleceniami producenta. Przekonwertowane DNA będzie przechowywane w temperaturze -70°C do momentu użycia. Analizy metylacji zostaną przeprowadzone przy użyciu topnienia w wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym (LightCycler® 480, Roche Applied Science). Wyniki zostaną potwierdzone przez bezpośrednie sekwencjonowanie (zmodyfikowana metoda Sangera: ddNTP znakowane czterema różnymi fluoroforami).