Abordagem Step Down em Crianças com Alergia ao Leite de Vaca (SDACMA)

Serão convidadas a participar do estudo 60 crianças com ALV mediada por imunoglobulina E, observadas consecutivamente em Centros Terciários de Alergia Alimentar, que atenderem aos critérios de inclusão. Dados anamnésticos, demográficos, antropométricos e clínicos, bem como informações sobre fatores sociodemográficos, condições familiares e de vida, história parental de doenças alérgicas, número de irmãos e posse de animais de estimação serão obtidos dos pais de cada criança e registrados em um banco de dados clínico.

Em seguida, em todos os sujeitos será realizado um desafio alimentar oral com EHCF + LGG. Apenas os indivíduos com desafio alimentar oral negativo serão alocados aleatoriamente para um dos dois grupos de intervenções dietéticas por um período de acompanhamento de 12 meses: o grupo 1 recebeu AAF e o grupo 2 recebeu EHCF + LGG.

O uso eficaz da fórmula será avaliado durante o estudo por nutricionistas que aconselham os pais sobre questões que podem surgir durante a dieta de eliminação. Os pais ou cuidadores serão solicitados a manter um registro diário do uso da fórmula. A quantidade preparada (milímetros de água e número de colheres de fórmula) e a quantidade que sobra após cada consumo serão registradas em um diário para avaliar a quantidade consumida pela criança.

Na inscrição, após 6 e 12 meses, o crescimento corporal será avaliado pelo peso corporal, comprimento corporal e circunferência da cabeça medidos na inscrição, após 6 e 12 meses de acompanhamento com referência aos gráficos de crescimento. Visitas não agendadas serão feitas se necessário.

Além disso, na inscrição, após 6 e 12 meses, os investigadores realizarão:

1. Todos os procedimentos de desafio alimentar oral serão realizados de forma duplamente cega em 2 dias consecutivos. Equipamentos de emergência completos e medicamentos (epinefrina, anti-histamínicos, esteróides) estarão à mão. O desafio será interrompido no aparecimento de sintomas clínicos ou quando a dose mais alta for atingida. A criança será observada por 2 horas e, em seguida, receberá alta.
2. Teste cutâneo em picada (leite integral, caseína, α-lactalbumina, β-lactoglobulina): serão aplicados alérgenos e leite fresco no antebraço volar do paciente: leite de vaca (CM) contendo 3,5% de gordura. Os testes cutâneos por picada foram realizados com lanceta de pico único de 1 mm (ALK, Copenhague, Dinamarca), com dicloridrato de histamina (10 mg/ml) e solução salina isotônica (NaCl 0,9%) como controle positivo e negativo, respectivamente. As reações serão registradas com base no maior diâmetro (em milímetros) da pápula e alargamento aos 15 min. O resultado do SPT será considerado "positivo" se a pápula for maior ou igual a 3 mm, sem reação do controle negativo.
3. IgE total e IgE específica e Imunoglobulina G 4 contra proteínas e epítopos do leite de vaca: faremos uma amostra de sangue venoso; o soro dos pacientes será coletado usando tubos separadores de soro e foi obtido por centrifugação por 10-15 minutos. O soro será congelado rapidamente e armazenado a -80 °C até análise posterior. Do soro, IgE total e IgE e IgG4 específicos contra proteínas e epítopos do leite de vaca serão analisados ​​por imunoensaio enzimático.
4. Composição da microbiota intestinal: uma amostra de fezes será coletada e imediatamente congelada a -80°C e armazenada até análise posterior. O DNA genômico total (gDNA) será isolado do material fecal utilizando um DNA específico. O kit de isolamento e a composição da microbiota intestinal serão analisados ​​usando uma abordagem para bactérias e uma abordagem de sequenciamento da região espaçadora transcrita interna (sequenciamento de alto rendimento).
5. Produção fecal e sérica de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs): será coletada amostra de fezes e soro. Um grama de amostra fecal será pesado, diluído 1:2 em solução salina tamponada com fosfato estéril e homogeneizado. Os sobrenadantes serão então obtidos por centrifugação (10 000g, 30 minutos, 4°C), filtrados em filtros de 0,2 μm e armazenados a -80°C até a análise. O soro dos pacientes será coletado em tubos separadores de soro e obtido por centrifugação por 10-15 minutos. O soro será congelado rapidamente e armazenado a -80 °C até análise posterior. A análise de SCFAs será realizada por cromatografia gasosa-espectrometria de massa (MS) para medir as concentrações de ácido acético, propiônico e butírico em amostras fecais.
6. Nível sérico de interleucina (IL)-4, IL-5, IL-13, IL-10, interferon (IFN)-γ: faremos uma amostra de sangue venoso; o soro dos pacientes será coletado usando tubos separadores de soro e foi obtido por centrifugação por 10-15 minutos. O soro será congelado rapidamente e armazenado a -80 °C. A partir do soro, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IFN-γ serão determinados por ELISA (kit específico para cada citocina).
7. Estado de metilação da região promotora de genes envolvidos na alergia mediada por IgE, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 e IFN-γ e de FoxP3+: sangue venoso será obtido dos pacientes e DNA será extraída de leucócitos usando o DNA Extraction Kit. O DNA extraído será modificado com bissulfito de sódio usando o kit Methylation Gold (ZYMO Research Co.) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA convertido será armazenado a -70°C até ser utilizado. As análises de metilação serão realizadas usando fusão de alta resolução em tempo real (LightCycler® 480, Roche Applied Science). Os resultados serão confirmados por sequenciamento direto (método de Sanger modificado: ddNTPs marcados com quatro fluoróforos diferentes).